今天分享一篇发表在MP上面的一个paper，是中国科学院分子植物科学卓越创新中心发表的，题目为"Single-cell RNA sequencing reveals a hierarchical transcriptional regulatory network of terpenoid biosynthesis in cotton secretory glandular cells"的研究论文。但是好像是Research report，我还特地查了一下research article和research report的区别，以前只见过MP的perspective。Research report好像不能超过3500 words，4个图。
这个paper阐述，他们首次利用单细胞转录组测序技术对棉花真叶不同细胞的基因表达进行全面分析，揭示了棉花叶片中萜类化合物代谢的空间分布规律，并从单细胞水平探究了陆地棉真叶在发育过程中和生物胁迫下萜类代谢的级联转录调控网络，为深入了解其他植物中关键化合物组分的生物合成、储存及调控机制提供了新的见解。
=========实验设计=========
这个paper中，选用幼嫩（15天）的陆地棉真叶进行单细胞转录组测序，3个重复，共获得28,655个单细胞转录组。
=========实验结果===========
1. 棉花叶片单细胞图谱构建
经质量控制、降维聚类后，最终鉴定到6种细胞类型（图1A和1B），分别是叶肉细胞（MC）、表皮细胞（EC）、保卫细胞（GC）、维管束细胞（VC）、增殖细胞（PC）和分泌型腺体细胞（SGC）【其实说实话，从示意图来看，我不是特别确定什么是SGC，是棉花特有的吗？我也是第一次在leaf的示意图中见到】。然后又用原位杂交验证了一些比较出名的marker基因（图1C-1H）。然后作者又分析了每个cell类型特异表达基因的GO富集（图2A），比如叶肉细胞大多数与光合作用相关，腺体细胞大多数与类异戊二烯的合成相关。
图1
2. 非挥发性和挥发性萜类在腺体中特异合成
接下来，作者探索了棉酚合成的单细胞表达特征。通过原位质谱，研究人员发现棉酚、半棉酚和半棉酚酮等均在棉花腺体中特异性积累，但这些化合物是否由腺体细胞合成，或由其它细胞合成后运输到腺体中尚不清楚（图2B）。研究团队分析发现已知棉酚合成途径及其上游甲羟戊酸途径(mevalonic acid pathway, MVA pathway)酶基因均在棉花分泌型腺体细胞中特异表达（图2C），表明棉酚等代谢物由棉花腺体细胞合成，并暗示了棉酚途径和上游的甲羟戊酸途径可能是被共同调控的（图2）。
另外，作者还发现其它负责挥发性单萜和倍半萜合成的萜类合酶（附图6A）同样在分泌型腺体细胞中特异表达，证明挥发性萜类化合物也是在棉花分泌型腺体细胞中合成（图2D）。通过TPS6的VIGS也证实了它在一些萜类化合物中的功能。
最后作者总结了一个从MVA到棉酚以及其它萜类化合物的合成模型（图2E）。
图2
附图6
3. 挥发性和非挥发性萜类化合的合成是受HSFA4a和NAC42调控的
基于前面的发现，作者可以在SGC里面发现一大批特异表达的基因，而这些基因可能调控了萜类的合成。用比较严格的标准，作者鉴定了20个特异表达的转录因子（附图7）。
附图7
最后，作者落脚到了两个新的转录因子GoHSFA4a和GoNAC42。GUS染色显示他们在pigment 里面特异表达（图3B）。VIGS敲除这2个基因之后发现棉酚相关的萜类（图3C）以及发挥性的半倍萜（图3D），MEP通路相关的一些单帖（图3E）显著下降。同时MVA途径，棉酚合成以及一些TPS在VIGS植株中也显著下降（图3F）。亚细胞定位显示GoHSFA4a和GoNAC42均位于细胞核（附图13A）。LUC实验结果表明这2个转录因子激活了MVA和棉酚途径上的基因（图3G,3H和附图13B）。酵母双杂也表明HSFA4a可以直接和MVA途径的HMGS以及棉酚途径的CYP736A196互作（图3I和附图13C）。而NAC42则可以和HMGR以及DH1基因互作（图3J和附图13D）。
图3
附图13
4. GoPGF在腺体细胞里面激活GoHSFA4a和GoNAC42的表达
GoPGF是已知的非常重要的一个调控腺体发育和棉酚合成的基因，因此作者接下来探索了GoPGF和这2个转录因子的关系。在GoPGF敲除的植株中，这两个转录因子的表达明显降低（图4A）。Chip-seq结果表明GoPGF可以直接结合到这2个转录因子的promoter区域（图4B）。酵母双杂也表明可以和这2个转录因子直接互作，并且和HSFA4a的G-box，和NAC42的E-box（图4C，4D）。LUC实验也获得了同样的结果（图4E）。但是这2个转录因子之间并不互作。
图4
5. GoHSFA4a和GoNAC42介导生物胁迫下萜类的合成
一般萜类和棉酚在抗虫和病原菌的防御上有着重要的作用。所以作者接下来又查看了这2个转录因子在虫子和病原菌侵染下的功能。在病原菌侵染和虫子侵染的样品中，这2个转录因子显著升高，但是GoPGF则基本没有变化（图4F，4G）。也就是说这两个转录因子可以独立于GoPGF响应病菌侵染和昆虫取食等生物胁迫。也就是说HSFA4a和NAC42这2个转录因子起着生物胁迫和棉酚，萜类合成的桥梁。
最后作者给出了一个总结模型（图4H）。
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