参考：
测试所用的数据链接: https://pan.baidu.com/s/1TUysqHHbXrWGi7QGt-6L1g 提取码: uqgh
image.png
Monocle[7]是一个基于pseudotime分析的软件包。它通过从一系列差异表达的基因来描述细胞间的距离远近，由此得到类似树状的分叉图象来表示细胞间的差异性。 提供了聚类，pseudotime, 差异分析等多种功能，该项目的网址如下
image.png
主要内容
1. 读取数据
2.预处理过滤细胞
3. 细胞分群/聚类
step1：dispersionTable()
step2：plot_pc_variance_explained() 耗时
step3: 进行降维和聚类
4.筛选基因(用于拟分析时序)
4.1 一般过滤标准
4.2 使用差异表达基因BEAM分析
5.推断发育轨迹
5.1. 选合适基因
5.2 降维
5.3 细胞排序
小结：
主要介绍使用该R包进行pseudotime分析的步骤.
Tips : pseudotime分析本质上就是输入基因及其表达量矩阵，计算拟时序的值。并且选取一些基因，用于降维可视化。聚类只是降维后颜色填充而已.
1. 读取数据
monocle包有很多种读取数据的方式 ，这里只展示其中三种：（I）直接读取;（II）来源于seurat2 包; （III）来源于seurat3包。
Tips : 由于版本更替较快，seurat2 可以直接导入monocle2.但是seurat3却要手动写代码导入.
library(monocle)
library(DDRTree)
library(pheatmap)
library(data.table)
library(plyr)
下面以10x 数据为例，最好通过seurat对象直接读入monocle2 方便一些.
（1）直接读取： 当有三个文件，expr_matrix ; sample_info ;gene_annotation.
expr_matrix <- read.delim(nUMI.summary.file)
sample_info <- data.frame(sampleID=colnames(expr_matrix))
gene_annotation <- data.frame(symbol=rownames(expr_matrix))
pd <- new("AnnotatedDataFrame", data = sample_info)
fd <- new("AnnotatedDataFrame", data = gene_annotation)
d <- newCellDataSet(as.matrix(expr_matrix), phenoData = pd, featureData = fd)
（2）来源于seurat2 包，数据如下：
image.png
## 切换到工作目录，读入三个文本文件.
pbmc.data <- Read10X(data.dir = ".")
pbmc <- CreateSeuratObject(counts = pbmc.data, project = "10XPBMC")
## seurat2 可以直接读入
sce <- importCDS(pbmc)
（3） 来源于seurat3包：
差别之处，不能直接用importCDS 导入.
## 由seurat3 导入函数newimport 替代上面的importCDS功能.
newimport <- function(otherCDS, import_all = FALSE) {
if(class(otherCDS)[1] == 'Seurat') {
requireNamespace("Seurat")
data <- otherCDS@assays$RNA@counts
if(class(data) == "data.frame") {
data <- as(as.matrix(data), "sparseMatrix")
}
pd <- tryCatch( {
pd <- new("AnnotatedDataFrame", data = otherCDS@meta.data)
pd
},
#warning = function(w) { },
error = function(e) {
pData <- data.frame(cell_id = colnames(data), row.names = colnames(data))
pd <- new("AnnotatedDataFrame", data = pData)
message("This Seurat object doesn't provide any meta data");
pd
})
# remove filtered cells from Seurat
if(length(setdiff(colnames(data), rownames(pd))) > 0) {
data <- data[, rownames(pd)]
}
fData <- data.frame(gene_short_name = row.names(data), row.names = row.names(data))
fd <- new("AnnotatedDataFrame", data = fData)
lowerDetectionLimit <- 0
if(all(data == floor(data))) {
expressionFamily <- negbinomial.size()
} else if(any(data < 0)){
expressionFamily <- uninormal()
} else {
expressionFamily <- tobit()
}
valid_data <- data[, row.names(pd)]
monocle_cds <- newCellDataSet(data,
phenoData = pd,
featureData = fd,
lowerDetectionLimit=lowerDetectionLimit,
expressionFamily=expressionFamily)
if(import_all) {
if("Monocle" %in% names(otherCDS@misc)) {
otherCDS@misc$Monocle@auxClusteringData$seurat <- NULL
otherCDS@misc$Monocle@auxClusteringData$scran <- NULL
monocle_cds <- otherCDS@misc$Monocle
mist_list <- otherCDS
} else {
# mist_list <- list(ident = ident)
mist_list <- otherCDS
}
} else {
mist_list <- list()
}
if(1==1) {
var.genes <- setOrderingFilter(monocle_cds, otherCDS@assays$RNA@var.features)
}
monocle_cds@auxClusteringData$seurat <- mist_list
} else if (class(otherCDS)[1] == 'SCESet') {
requireNamespace("scater")
message('Converting the exprs data in log scale back to original scale ...')
data <- 2^otherCDS@assayData$exprs - otherCDS@logExprsOffset
fd <- otherCDS@featureData
pd <- otherCDS@phenoData
experimentData = otherCDS@experimentData
if("is.expr" %in% slotNames(otherCDS))
lowerDetectionLimit <- otherCDS@is.expr
else
lowerDetectionLimit <- 1
if(all(data == floor(data))) {
expressionFamily <- negbinomial.size()
} else if(any(data < 0)){
expressionFamily <- uninormal()
} else {
expressionFamily <- tobit()
}
if(import_all) {
# mist_list <- list(iotherCDS@sc3,
# otherCDS@reducedDimension)
mist_list <- otherCDS
} else {
mist_list <- list()
}
monocle_cds <- newCellDataSet(data,
phenoData = pd,
featureData = fd,
lowerDetectionLimit=lowerDetectionLimit,
expressionFamily=expressionFamily)
# monocle_cds@auxClusteringData$sc3 <- otherCDS@sc3
# monocle_cds@auxOrderingData$scran <- mist_list
monocle_cds@auxOrderingData$scran <- mist_list
} else {
stop('the object type you want to export to is not supported yet')
}
return(monocle_cds)
}
导入monocle2
## 读入seurat3
pbmc.data <- Read10X(data.dir = ".")
pbmc <- CreateSeuratObject(counts = pbmc.data, project = "10XPBMC")
## 读入monocle2
sce <- newimport(pbmc)
本文采用第1种方式，读入文件
library(Seurat)
library(monocle)
expression_matrix <- readRDS("packer_embryo_expression.rds")
cell_metadata <- readRDS("packer_embryo_colData.rds")
gene_annotation <- readRDS("packer_embryo_rowData.rds")
## 数据框需要先保存为AnnotatedDataFrame 格式，才可以创建newCellDataSet 对象
# Error: CellDataSet 'phenoData' is class 'data.frame' but should be or extend 'AnnotatedDataFrame'
pd <- new("AnnotatedDataFrame", data = cell_metadata)
fd <- new("AnnotatedDataFrame", data = gene_annotation)
sce <- newCellDataSet(expression_matrix,
phenoData = pd,
featureData = fd,
lowerDetectionLimit = 0.1,
expressionFamily = VGAM::negbinomial.size()) # 默认参数
查看sce 类型：
> sce
CellDataSet (storageMode: environment)
assayData: 20222 features, 6188 samples
element names: exprs
protocolData: none
phenoData
sampleNames: AAACCTGCAAGACGTG-300.1.1 AAACCTGGTGTGAATA-300.1.1 ...
TTTGTCAAGTACACCT-b02 (6188 total)
varLabels: cell n.umi ... State (21 total)
varMetadata: labelDescription
featureData
featureNames: WBGene00010957 WBGene00010958 ... WBGene00007064 (20222 total)
fvarLabels: id gene_short_name num_cells_expressed use_for_ordering
fvarMetadata: labelDescription
experimentData: use 'experimentData(object)'
Annotation:
查看一下数据读入到monocle2里面，它的表达分布类型：
sce@expressionFamily
## Family: negbinomial.size
##
## Negative-binomial distribution with size known
##
## Links: loge(mu)
## Mean: mu
## Variance: mu * (1 + mu / size) for NB-2
注意到构建CDS对象过程中有一个参数是：expressionFamily ，它是选择了一个数据分布，例如FPKM/TPM 值是log-正态分布的；UMIs和原始count值用负二项分布模拟的效果更好。负二项分布有两种方法，这里选用了negbinomial.size，另外一种negbinomial稍微更准确一点，但速度大打折扣，它主要针对非常小的数据集，如下表：
由于输入10x genomic 数count 类似，所以表达分布为 negbinomial.size()
| Family function | 数据类型 | 备注 |
|---|---|---|
| negbinomial.size() | 原始计数值, 比如UMIs counts | Negative binomial distribution with fixed variance |
| negbinomial() | 原始计数值, 比如UMIs counts | 比negbinomial.size()精确一点, 但是非常慢. |
| tobit() | FPKM, TPM | Tobits are truncated normal distributions. 注意这点不是log-transformed FPKM/TPM |
| gaussianff() | log-transformed FPKM/TPMs, Ct values from single-cell qPCR | 符合高期分布的数值 |
2.预处理
和处理RNA-seq数据一样，monocle会有一些预处理的步骤，这包括估计size factors和dispersions，以及去除一些质量比较差的细胞。
-
第一行代码用于评估每个细胞的sizefactor, 用于后续归一化；
-
第二行代码计算基因的方差,这一步可能会提醒我们有多少的outlier的细胞。所以下一步就是要去除掉这些细胞。
cds <- estimateSizeFactors(cds)
cds <- estimateDispersions(cds)
# Removing 143 outliers
通过pData和fData两个函数，可以查看基因和细胞的相关信息，示意如下
- 查看细胞注释信息：pData.
image.png
- 查看基因注释信息：fData
image.png
过滤细胞
在准备样品细胞的过程中，不可避免地会引入一下死的细胞，或者说是doublets(两个细胞被标记成一个细胞)。 这些细胞对下游分析的影响会比较大，它们很有可能会占去很大分析权重。所以我们需要把它们去除掉。 去除它们的办法就是设置一个比较合理的表达总值的上下限，然后把处于上下限外围的细胞都去除掉。
- 首先我们来查看一下低表达的基因。
### detectGenes计算每一个细胞表达的基因个数.
sce <- detectGenes(sce, min_expr = 0.1)
### 保留在10个细胞中表达的基因，当做表达基因.
expressed_genes <- row.names(subset(fData(sce),
num_cells_expressed >= 10))
我们将表达值在10以上的基因保存为expressed_genes。下面的步骤会用到保存好的表达的基因。
-
接下来我们要去除掉死细胞或者doublets了。
head(pData(sce))
一般的，我们是没有数据告诉我们哪些细胞是死的或者空的，哪些细胞是doublets的。但是通常而方言，我们都会拿到RPC(reads per cell)的计数，我们可以人为的设定一下表达总值的上下限。
pData(sce)$Total_mRNAs <- Matrix::colSums(exprs(sce))
sce <- sce[, pData(sce)$Total_mRNAs < 1e6 ]
##设置上下限：
upper_bound <- 10^(mean(log10(pData(sce)$Total_mRNAs)) +
2*sd(log10(pData(sce)$Total_mRNAs)))
lower_bound <- 10^(mean(log10(pData(sce)$Total_mRNAs)) -
2*sd(log10(pData(sce)$Total_mRNAs)))
## 可视化
qplot(Total_mRNAs, data = pData(sce), geom = "density") +
geom_vline(xintercept = lower_bound) +
geom_vline(xintercept = upper_bound) + xlim(0, 6000)+
theme_classic()
可视化RPC(reads per cell) 分布
image.png
过滤不合格细胞
## 保留下通过标准的细胞
sce <- sce[,pData(sce)$Total_mRNAs > lower_bound &
pData(sce)$Total_mRNAs < upper_bound]
## 新的sce 数据,评估细胞表达基因数.
sce <- detectGenes(sce, min_expr = 0.1)
> sce
CellDataSet (storageMode: environment)
assayData: 20222 features, 5943 samples
element names: exprs
protocolData: none
phenoData
sampleNames: AAACCTGCAAGACGTG-300.1.1 AAACCTGGTGTGAATA-300.1.1
... TTTGTCAAGTACACCT-b02 (5943 total)
varLabels: cell n.umi ... Total_mRNAs (20 total)
varMetadata: labelDescription
featureData
featureNames: WBGene00010957 WBGene00010958 ... WBGene00007064
(20222 total)
fvarLabels: id gene_short_name num_cells_expressed
fvarMetadata: labelDescription
experimentData: use 'experimentData(object)'
Annotation:
细胞数目有6188 变成现在的5943个.
检查过滤细胞的效果，过滤后的值基本上是符合lognormal分布的。
# Log-transform each value in the expression matrix.
L <- log(exprs(sce[expressed_genes,]))
# Standardize each gene, so that they are all on the same scale,
# Then melt the data with plyr so we can plot it easily
melted_dens_df <- melt(Matrix::t(scale(Matrix::t(L))))
# Plot the distribution of the standardized gene expression values.
qplot(value, geom = "density", data = melted_dens_df) +
stat_function(fun = dnorm, size = 0.5, color = 'red') +
xlab("Standardized log(counts)") +
ylab("Density")
理想的图：
image.png
得到过滤后的矩阵，可以分别进行聚类和拟时序分析.
3. 细胞分群/聚类
不使用marker 基因的细胞分类方法
使用函数clusterCells()，根据整体的表达量对细胞进行分组。例如，细胞表达了大量的与成肌细胞相关的基因，但就是没有成肌细胞的marker--MYF5 ，我们依然可以判断这个细胞属于成肌细胞。
step1：dispersionTable()
首先就是判断使用哪些基因进行细胞分群。当然，可以使用全部基因，但这会掺杂很多表达量不高而检测不出来的基因，反而会增加噪音。挑有差异的，挑表达量不太低的
disp_table <- dispersionTable(sce)
unsup_clustering_genes <- subset(disp_table,
mean_expression >= 0.1) ## 数值因实验而不同
sce <- setOrderingFilter(sce, unsup_clustering_genes$gene_id)
plot_ordering_genes(sce)
image.png
其中, setOrderingFilter函数设置了将来会用于分群的细胞。这一步对于分群非常关键，所以可以试着使用不同的方法来过滤基因，以期达到满意的效果。
plot_ordering_genes根据这些基因的平均表达水平展示了基因的表达差异程度，红线表示Monocle基于这种关系对分散的期望。 上图中实黑的为会使用的基因，灰色的是过滤掉的基因。
step2：plot_pc_variance_explained() 耗时
然后选一下主成分
plot_pc_variance_explained(cds, return_all = F,max_components = 100) # norm_method='log'
image.png
上图与Seurat中使用到的PCElbowPlot类似，我们可以看到大约多少的PC将会被我们使用。 可以看到大约在15的时候就已经到的平原区了。下面试着分群。
step3: 进行降维和聚类
根据上面👆的图，选择合适的主成分数量（这个很主观，可以多试几次），这里选前15个成分（需要注意的 使用主成分会影响后面结果）
关于处理批次效应：例如在芯片数据中经常会利用SVA的combat函数。
磨平批次效应实际上就是去掉各个组的前几个主成分
# 进行降维 ，设置降维维度15.
cds <- reduceDimension(sce, max_components = 2, norm_method = 'log',
num_dim = 15, reduction_method = "tSNE", verbose = TRUE)
# Remove noise by PCA ...
# Reduce dimension by tSNE ...
### 如果需要去除批次效应(batch 和 几群细胞基因表达量数目)
# cds <- reduceDimension(cds, max_components = 2, num_dim = 6,
# reduction_method = 'tSNE',
# residualModelFormulaStr = "~batch + #num_genes_expressed",
# verbose = T)
# 进行聚类 （指定cluster为4的时候，只能画出来3个,为什么？）
cds <- clusterCells(cds, num_clusters = 4)
# Distance cutoff calculated to 4.826512
## 查看聚类效果
head(cds@phenoData@data)
# 查看tSNE图
plot_cell_clusters(cds,x=1,y=2, color_by = "Cluster")
# 画具体基因的表达分布图
#plot_cell_clusters(HSMM, 1, 2, color = "Cluster",
# + markers = c("CDC20", "GABPB2"))
image.png
4.筛选基因(用于拟分析时序)
4.1 一般过滤标准
筛选基因没有一个固定标准，可以根据自己的需要灵活选择，这里只展示其中1种 .
disp_table <- dispersionTable(sce)
unsup_clustering_genes <- subset(disp_table, mean_expression >= 0.1)
## 得到用于拟时序分析基因
ordering_genes <- row.names(unsup_clustering_genes)
image.png
4.2 使用差异表达基因
对于差异表达分析，可以像RNA-seq一样，直接到不同属性的样品进行分析
fullModelFormulaStr ： 分组进行差异分析的变量.
我们可以看到，只要有不同的pData属性，我们都可以做差异表达分析。比如State：
## 差异分析非常耗时，运行时间在几分钟至十几分钟不等
diff_test_res <- differentialGeneTest(sce[expressed_genes, ],
fullModelFormulaStr = "Cluster")
sig_genes <- subset(diff_test_res, qval < 0.1)
sig_genes[1:6,c("gene_short_name", "pval", "qval")]
## 得到用于拟时序分析基因
ordering_genes <- row.names(sig_genes)
下面是可选部分👇
再比如 Pseudotime
diff_test_res <- differentialGeneTest(sce[expressed_genes, ],
fullModelFormulaStr = "~sm.ns(Pseudotime)")
sig_genes <- subset(diff_test_res, qval < 0.1)
sig_genes[1:6,c("gene_short_name", "pval", "qval")]
作图（注意要将基因名变成character）
cg=as.character(head(sig_genes$gene_short_name))
# 普通图
plot_genes_jitter(sce[cg,],
grouping = "State", ncol= 2)
# 还能上色
plot_genes_jitter(sce[cg,],
grouping = "State",
color_by = "State",
nrow= 3,
ncol = NULL )
还可以绘制热图
sig_genes <- sig_genes[order(sig_genes$qval), ]
plot_pseudotime_heatmap(sce[row.names(sig_genes)[1:20],],
num_clusters = 3,
cores = 1,
show_rownames = T)
得到类似图
image.png
BEAM分析
BEAM分析的目的是比较分枝点与分枝末端的差异。
BEAM_res <- BEAM(sce[expressed_genes, ], branch_point = 1, cores = 4)
BEAM_res <- BEAM_res[order(BEAM_res$qval),]
BEAM_res <- BEAM_res[,c("gene_short_name", "pval", "qval")]
plot_genes_branched_heatmap(sce[row.names(subset(BEAM_res,
qval < 1e-4)),],
branch_point = 1,
num_clusters = 4,
cores = 1,
use_gene_short_name = T,
show_rownames = T)
image.png
可以针对基因做图
plot_genes_branched_pseudotime(sce[rownames(subset(BEAM_res, qval < 1e-8)), ],
branch_point = 1, color_by = "orig.ident",
ncol = 3)
image.png
上面是可选部分 👆.
5.推断发育轨迹
用上面过滤的基因进行降维， 以方便下一步将细胞分布到不同的状态之间，可视化拟时序得分.
5.1: choosing genes that define progress
5.2: reducing the dimensionality of the data
5.3: ordering the cells in pseudotime
5.1. 选合适基因
得到上面两种过滤的基因集：unsup_clustering_genes 或者 diff_test_res，选取合适基因进行排序.
## 以差异基因为例：
## ordering_genes <- row.names (subset(diff_test_res, qval < 0.01))
cds <- setOrderingFilter(cds, ordering_genes)
plot_ordering_genes(cds)
image.png
5.2 降维
默认使用DDRTree的方法进行降维分析，代码如下
cds <- reduceDimension(
cds,
max_components = 2,
method = 'DDRTree')
5.3 细胞排序
然后就是细胞排序 ，代码如下：
cds <- orderCells(cds)
运行之后，对于每个细胞，会给出一个pseudotime值，示意如下
image.png
可视化代码：
- 默认用"state" 填充。应该是cluster 含义.
plot_cell_trajectory(sce)
image.png
- 降维之后，在二维空间展示细胞pseudotime的分布，可以看到是一个树状结构，除了上述方法外，还可以根据pseudotime的值给细胞赋颜色，代码如下
plot_cell_trajectory(sce, color_by = "Pseudotime")
image.png
其实就是将fData中对应的列设置为颜色，如果想要观察不同细胞亚型的分布，可以在fData中新增一列细胞对应的cluster ID, 然后用这一类来设置颜色。
对于pseudotime分析，我们需要明白它的基本输入就是一张基因在细胞中表达量的表格，与细胞的聚类结果无关，只不过在可视化的时候根据聚类的结果填充了颜色而已。
另外，plot_genes_in_pseudotime 可以对基因在不同细胞中的表达量变化进行绘图
plot_genes_in_pseudotime(cds[cg,],
color_by = "State")
小结：
【Workflow以及与Seurat的异同】
-
①创建CellDataSet对象（下简称CDS对象）
若要创建新的CDS对象，则需要整理出3个输入文件（基因-细胞表达矩阵、细胞-细胞特征注释矩阵、基因-基因特征注释矩阵），但方便的是，Monocle支持从Seurat中直接导入对象，通过importCDS命令实现。
在创建之后，也会进行数据过滤和标准化，不同的是Seurat是基于作图的方法去筛选掉异常的细胞，而Monocle的过滤方法则是根据表达数据的数学关系来实现。
上限：
image.png
image.png
其中X为基因表达总数, n 为细胞数，sd为表达水平方差
大概就是以一个大致的细胞表达水平为基准，表达量太高的跟太低的去除掉。
-
②通过已知的Marker基因分类细胞
方法一：通过一些现有的生物/医学知识手动赋予它们细胞名，将这些细胞分为几大类，然后再聚类细胞。
方法二：与Seurat包的分类细胞方法类似，筛选出差异表达基因用于聚类，然后再根据每一个cluster的marker赋予细胞名。 -
③聚类细胞
采用的也是t-SNE算法。 -
④将细胞按照伪时间的顺序排列在轨迹上
-
Step1：选择输入基因用于机器学习
这个过程称为feature selection（特征选择），这些基因对轨迹的形状有着最重要的影响。我们应该要选择的是最能反映细胞状态的基因。
如果直接通过Seurat输出的一些重要的基因（比如每个cluster中的高FC值基因）作为输入对象的话就能够实现一个“无监督”分析。或者也可以利用生物学知识手动选择一些重要的基因进行“半监督”分析。 -
Step2：数据降维
利用Reversed graph embedding算法将数据降维。
相对于PCA来说这个算法更能够反应数据的内部结构（据monocle网站说是这样） -
Step3：将细胞按照伪时间排序
这个过程称为manifold learning（流形学习）。Monocle利用轨迹来描述细胞如何从一个状态转换到另一个状态。得到的是一个树状图，树的根部或树干表示的是细胞最初的状态（如果有的话），随着细胞的变化就沿着分叉树枝发展。一个细胞的伪时间值（pseudotime value）为它的位置沿着树枝到根部的距离。
-
分析scRNA-seq的数据的关键在于如何对细胞进行cluster。这其中有很多的算法，而之后的降维分析比如tSNE其实主要还是为了数据图形化显示方便。在细胞分群之后，差异表达分析其实与第三章的RNA-seq并无二致，我们只需要对需要比较的因素做到心中有数即可。
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