busco软件使用详解

作者: 笺牒九州的怪咖 | 来源:发表于2022-12-12 15:41 被阅读0次

BUSCO - 组装质量评估软件

BUSCO - Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs 直译的话就是普遍通用的单拷贝直系同源测试
BUSCO通过同源基因数据库从基因完整度来评价基因组组装结果。BUSCO首先构建了不同物种的最小基因集，然后使用HMMER，BLAST,Augustus等工具分析组装结果中的同源基因，从而定量评估组装是否完整。

文献

《BUSCO: assessing genome assembly and annotation completeness with single-copy orthologs》

说明

BUSCO是一款使用python语言编写的对转录组和基因组组装质量进行评估的软件。在相近的物种之间总有一些保守的序列，而BUSCO就是使用这些保守序列与组装的结果进行比对，鉴定组装的结果是否包含这些序列，包含单条、多条还是部分或者不包含等等情况来给出结果。

BUSCO 软件根据OrthoDB 数据库，构建了几个大的进化分支的单拷贝基因集。将转录本拼接结果与该基因集进行比较，根据比对上的比例、完整性，来评价拼接结果的准确性和完整性。

BUSCO使用其他的工具搭建了流程，它的流程是

genoem assemble : tBLASTn --> Augustus --> HMMER3
Transcriptome   :             Find ORF --> HMMER3
Gene set        :                          HMMER3

1. 下载与安装【方便】

这里使用conda来自动安装BUSCO以及它的依赖工具。如果没有conda，那么可以查看这篇文章安装conda。

安装conda之后进行busco的安装。安装完毕之后，下载好数据库文件就可以直接跳到运行那一步了。下面的配置啊，安装之类的是针对【麻烦】的安装方式。

conda install busco

有时候在默认搜索库中没有找到相关信息，那么就尝试下面的方法

# 构建conda的python3环境
conda create --name python36 python=3.6
#  然后激活
conda activate python36
# 执行安装
conda install -c https://conda.anaconda.org/bioconda busco
# 在使用完busco之后可以退出python36环境
conda deactivate

如果使用conda安装成功，那么就执行2\. 下载数据库文件 -> 5\. 运行 -> 6\. 结果解读 -> 7\. 画图

使用conda自动完整安装过程，但是有时候没有管理员权限或者其他一些原因无法这样安装，那么就可以根据下面的方法进行安装。

1. 下载与安装【麻烦】

不使用conda安装的话，那么每一个工具需要单独下载，然后导入到环境变量当中去，让busco想用到它们的时候能够找得到它们。在对这种关联软件安装折磨之后对程序的安装的理解有帮助的，加油！

依赖的工具

Augustus
HMMER
Blast+

下载

下载软件包

#  ============ 下载BUSCO  ============ 
cd ~/Applications/download
wget -c https://gitlab.com/ezlab/busco/-/archive/master/busco-master.zip -O busco.zip

# ============ 下载依赖的工具 ============
# 下载Augustus
wget -c http://bioinf.uni-greifswald.de/augustus/binaries/augustus.current.tar.gz
# 下载HMMER
wget -c http://eddylab.org/software/hmmer/hmmer.tar.gz -O hmmer.tar.gz
# 下载Blast+
wget -c ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/LATEST/ncbi-blast-2.7.1+-x64-linux.tar.gz

安装

cd ~/Applications/download

# === 安装busco ===
unzip busco.zip
# 改名
mv busco-master busco 
# 移动到外部
mv busco ../
cd ../busco
# 安装
python setup.py install

cd ~/Applications/download
# === 安装Augustus ===
tar -xzvf augustus.current.tar.gz
cd augustus-3.3.1
cd ../
mv augustus-3.3.1 ../
cd ../augustus-3.3.1
# 打开common.mk文件，将ZIPINPUT = true注释掉（即在最前面加一#号）
vim common.mk
# 安装
make

cd ~/Applications/download
# === 安装HMMER ===
tar -xzvf hmmer.tar.gz
cd hmmer-3.2.1
./configure
make

# === 安装blast+ ===
tar -xzvf ncbi-blast-2.7.1+-x64-linux.tar.gz
# 改名
mv ncbi-blast-2.7.1+ ../blast+-2.7.1-linux

# 删除安装包
cd ~/Applications/download
rm busco.zip
rm augustus.current.tar.gz
rm hmmer.tar.gz
rm ncbi-blast-2.7.1+-x64-linux.tar.gz

2. 下载数据库文件

上面软件安装完毕之后，就开始下载数据库文件了，根据组装的物种来选择对应的数据库文件。

# 浏览器打开下列网址
https://busco.ezlab.org/

查找下载需要评估的组装的物种对应的类群（最近：最近发现了busco的库更新了，里面的数据库的分类更加详细了，但是大类还是下面5个，具体的详细类别这里就不列举了）

- Bacteria 细菌
- Protists 原生生物
- Metazoa 后生动物
- Fungi 真菌
- Plant 植物

例如下载植物的BUSCO的数据库（对着需要下载的类群的图片右键->复制链接地址，之后就得到了下载链接，然后在命令行使用wget之类的下载命令下载），比如下面我下载的是植物相关的，我就下载的植物类群。

mkdir -p ~/database/BUSCO/
cd ~/database/BUSCO/
# 下载
wget -c https://busco.ezlab.org/datasets/embryophyta_odb9.tar.gz
# 解压文件
tar -xzvf embryophyta_odb9.tar.gz

下面在执行那一步对应的数据库的文件路径就是

~/database/BUSCO/embryophyta_odb9

3. 配置

这里配置是必须的，这一步需要仔细一些，路径出错的话是无法通过busco的检测的，在安装好软件之后 ~/Applications/busco/config/之中并没有config.ini文件，只有一个config.ini_default文件，可以把里面的内容复制下来，

方法1

新建一个config.ini文件或者直接复制一份

cp config.ini_default config.ini

方法2

也可以按照下面的说明进行

# 增加配置文件
vim ~/Applications/busco/config/config.ini

加入如下内容

# BUSCO specific configuration
# It overrides default values in code and dataset cfg, and is overridden by arguments in command line
# Uncomment lines when appropriate
[busco]
# Input file
;in = ./sample_data/target.fa
# Run name, used in output files and folder
;out = SAMPLE
# Where to store the output directory
# out_path = /workdir
# Path to the BUSCO dataset
;lineage_path = ./sample_data/example
# Which mode to run (genome / protein / transcriptome)
;mode = genome
# How many threads to use for multithreaded steps
;cpu = 1
# Domain for augustus retraining, eukaryota or prokaryota
# Do not change this unless you know exactly why !!!
;domain = eukaryota
# Force rewrite if files already exist (True/False)
;force = False
# Restart mode (True/False)
;restart = False
# Blast e-value
;evalue = 1e-3
# Species to use with augustus, for old datasets only
;species = fly
# Augustus extra parameters
# Use single quotes, like this: '--param1=1 --param2=2'
;augustus_parameters = ''
# Tmp folder
;tmp_path = ./tmp/
# How many candidate regions (contigs, scaffolds) to consider for each BUSCO
;limit = 3
# Augustus long mode for retraining (True/False)
;long = False
# Quiet mode (True/False)
;quiet = False
# Debug logs (True/False), it needs Quiet to be False
debug = True
# tar gzip output files (True/False)
;gzip = False
# Force single core for the tblastn step
;blast_single_core = True

[tblastn]
# path to tblastn
path = ~/Applications/blast+-2.7.1-linux/bin

[makeblastdb]
# path to makeblastdb
path = ~/Applications/blast+-2.7.1-linux/bin

[augustus]
# path to augustus
path = ~/Applications/augustus-3.3.1/bin

[etraining]
# path to augustus etraining
path = ~/Applications/augustus-3.3.1/bin

# path to augustus perl scripts, redeclare it for each new script        
[gff2gbSmallDNA.pl]                                                      
path = ~/Applications/augustus-3.3.1/scripts                         
[new_species.pl]                                                         
path = ~/Applications/augustus-3.3.1/scripts                         
[optimize_augustus.pl]                                                   
path = ~/Applications/augustus-3.3.1/scripts                         

[hmmsearch]                                                              
# path to HMMsearch executable                                           
path = ~/Applications/hmmer-3.2.1/src                                

[Rscript]                                                                
# path to Rscript, if you wish to use the plot tool                      
path = /usr/bin/

在新建好config.ini文件之后，

将config.ini文件中的out_path = /workdir前面加上#
因为这个工具的输出路径有时候会出错，所以干脆将它注释掉，之后假如运行busco之后，输出的路径就是你之前cd到的路径
之后一般需要改这几项对应的路径（里面的路径需要更改为你自己的工具的路径）

选项	相关
[tblastn]	blast+
[makeblastdb]	blast+
[augustus]	Augustus
[hmmsearch]	HMMER
[gff2gbSmallDNA.pl]	Augustus
[new_species.pl]	Augustus
[optimize_augustus.pl]	Augustus
[hmmsearch]	HMMER

🚩这些就是刚才我们安装的blast+和HMMER和Augustus的执行文件的路径，只需要把前面的路径改为你安装的程序的位置的路径就可以啦！

比如我的blast+是安装在~/Applications之下，执行文件在~/Applications/blast+-2.7.1-linux/bin 之中，比如你是安装在~/NAME/biosofts下面，那么对应的执行文件的路径就是~/NAME/biosofts/blast+-2.7.1-linux/bin。

其实可以看到上面的都是一些路径或者默认选项设置，读取配置文件然后设置这些项目进入程序是很多工具的方式。

4. 导入环境变量

这里没有对软件进行完整的安装，所以需要导入临时环境变量（防止在配置文件中busco没有找到相关程序）
下面的路径都是刚才安装的程序的对应的路径

# augustus工具的执行文件所在文件夹
export PATH="/home/ssd/Applications/augustus-3.3.1/bin:$PATH"
# augustus工具附加脚本所在文件夹
export PATH="/home/ssd/Applications/augustus-3.3.1/scripts:$PATH"
# augustus工具配置文件的所在位置 。AUGUSTUS_CONFIG_PATH 需要使用绝对路径
export AUGUSTUS_CONFIG_PATH="/home/ssd/Applications/augustus-3.3.1/config"
# hmmer工具的执行文件所在文件夹
export PATH="/home/ssd/Applications/hmmer-3.2.1/src:$PATH"
# blast+工具的执行文件所在文件夹
export PATH="/home/ssd/Applications/blast+-2.7.1-linux/bin:$PATH"

[可选]如果经常使用，建议加入永久的环境变量

# 打开.bash_profile文件
vim ~/.bash_profile

# 在末尾添加上面的导入环境变量的内容

5. 运行

开始评估

基本的使用方法为

run_BUSCO.py -i [组装的文件.fasta]  -l  [数据库文件夹] -o [输出文件名] -m [评估模式] [其他一些选项]

📍实际使用例子，如果是使用conda安装的BUSCO的话。执行的时候不需要写完整的路径，只需要写run_BUSCO.py。

# 首先cd到对应的组装文件的文件夹
# 

# -i 输入文件
# -l BUSCO的数据库文件
# -o 输出的文件名的后缀以及文件夹的名称
# -m 分析类型（genome、transcriptome、proteins）
# --cpu 线程数
~/Applications/busco/scripts/run_BUSCO.py \
    -i contigs.fasta \
    -l ~/database/BUSCO/embryophyta_odb9 \
    -o suffix\
    -m genome \
    --cpu 8

⚠️注意：在fasta文件中，一些组装工具生成的contig的名字是这种形式的>contig/1/12345之类的，这种fasta文件在运行的时候BUSCO会报错，解决办法就是将这种改名，老办法，perl单行程序。

cat contig.fasta | perl -p -e 's{/}{}g' > contig.new.fasta

6. 结果解读

在运行文件夹下会有

run_suffix 文件夹：因为上面-o选项设置了suffix，所以文件夹名称加上了后缀。在这个文件夹里面，有一个文件最为重要。就是short_summary_suffix.txt；

下面是个范例

# Summarized benchmarking in BUSCO notation for file assembly/spades/contigs.fasta
# BUSCO was run in mode: genome
    C:98.6%[S:98.6%,D:0.0%],F:0.0%,M:1.4%,n:148

    146 Complete BUSCOs (C)
    146 Complete and single-copy BUSCOs (S)
    0   Complete and duplicated BUSCOs (D)
    0   Fragmented BUSCOs (F)
    2   Missing BUSCOs (M)
    148 Total BUSCO groups searched

缩写	全称	说明	关系
C	Complete	多少个BUSCO测试基因被覆盖。	C = S + D
S	single-copy	多少个基因经过比对发现是单拷贝。	-
D	duplicated	多少个基因经过比对发现包含多拷贝。	-
F	Fragment	多少个基因经过比对覆盖不完全，只是部分比对上。	-
M	Miss	没有得到比对结果的基因数	-
Total	Total	总共测试的基因条目数	Total = C + F + M

C值表示和BUSCO集相比的完整度，M值表示可能缺少的基因数，D则是重复数。

一般来看，S似乎越大越好，M越小越好，说明组装的越完整，因为检测的单拷贝同源基因出现得多。但是D与F这两个数值越大不见得就是好的，因为组装的错误可能会带来这两个值的增大。

BUSCO评估结果：
一般情况下对于完整度较好的基因组组装结果来讲，Complete and single-copy越多越好，而Complete and duplicated和Missing越少越好，对于Fragmented也尽可能地少一些。

真实项目中，Complete BUSCOs (C) 的比例通常都能达到 80% 以上。

下面列举了三种比对的情况。

情况1 - 完全覆盖

说明: +表示组装得到基因序列 -表示用于测试的基因序列

组装 : ================+++++++==============
测试                   -------
                       或者
组装 : ==============+++++++++++============
测试                   -------

情况2 - 部分覆盖

组装 : ================+++++++==============
测试                   -----
                     /      \
                       或者
组装 : ================+++++++==============
测试                   -------
                     /        \

情况3 - 没有比对

组装 : ================+++++++==============
测试

一般来看S + D的数值也就是C的值越大越好，但是在文献中作者说如果D的数值太多的话可能意味着组装错误的可能性较大。因为一个基因（BUSCO数据库中该基因一般为单拷贝）被覆盖多次，那么可能就是说该基因所在的片段组装可能出现问题。
因为理论上

理论上：--------------------------------------------
实际上：--------   ----------    ----------    -----
错误的：--------                 -------------
           \\\\                    ///
          -----------     --------------

理论上组装之后各个片段之间应该前后有序，之间除了重复区域或者其他特殊片段之外不应该有可以重叠的地方。
例如

sequence1 : ..TAGTCGTGA                         GTGCATGCTGTAGC..
                       \                       /
                        AAAATTGG......CGATGAAAA
                       /                       \
sequence2 : ..GGGTAGCGG                         TTGACTAGCTAGCT..

也就是说中间一段序列是两个序列的共同部分，除非这个序列存在多个拷贝，否则就很可能是拼接错误。通常一般这种拼接错误的序列的两端会出现重复序列。另外如果是多倍体组装的话，D值也可能大。

基因组组装结果不能仅仅只是通过这一个软件来判定。比如还可以借助QUAST和常规指标N50、总的核酸量、点阵图等等多个辅助标准来进行综合的评估。

7. 画图

在执行完毕之后，可以使用generate_plot.py画图，这个图形说白了就是一种条形图。

首先把所有的经过BUSCO检测的结果聚集到一个文件夹之内

mkdir my_summaries
cp run_SPEC1/short_summary_SPEC1.txt my_summaries/.
cp run_SPEC2/short_summary_SPEC2.txt my_summaries/.
cp run_SPEC3/short_summary_SPEC3.txt my_summaries/.
cp run_SPEC4/short_summary_SPEC4.txt my_summaries/.
cp run_SPEC5/short_summary_SPEC5.txt my_summaries/.

然后运行

python scripts/generate_plot.py –wd my_summaries

image

这个图就是将刚才第6步中的那五个数值变成这种条形图显示，让这种多少的对比更加明显，当然了，你自己也可以使用正则表达式将数值抓取出来，之后输出到文件中，然后使用python或者R来画图也是可以的。

参考

Augustus安装错误

这种问题在Mac上安装出现的可能性比较大
y

cd auxprogs && make
make[1]: Entering directory '/home/jxyue/Tools/augustus-3.2.3/auxprogs'
cd bam2hints; make;
make[2]: Entering directory '/home/jxyue/Tools/augustus-3.2.3/auxprogs/bam2hints'
g++ -Wall -O2    -c bam2hints.cc -o bam2hints.o -I/usr/include/bamtools 
bam2hints.cc:16:27: fatal error: api/BamReader.h: No such file or directory
 #include <api/BamReader.h>
                           ^
compilation terminated.
Makefile:29: recipe for target 'bam2hints.o' failed
make[2]: *** [bam2hints.o] Error 1
make[2]: Leaving directory '/home/jxyue/Tools/augustus-3.2.3/auxprogs/bam2hints'
Makefile:7: recipe for target 'all' failed
make[1]: *** [all] Error 2
make[1]: Leaving directory '/home/jxyue/Tools/augustus-3.2.3/auxprogs'
Makefile:7: recipe for target 'all' failed
make: *** [all] Error 2

解决方法

第一步：安装好bamtools

简单的安装方法

brew install bamtools libbamtools-dev

其他安装方法

git clone git://github.com/pezmaster31/bamtools.git
mkdir build
cd build
cmake -DCMAKE_INSTALL_PREFIX=/your/path/to/bamtools ..
make
make install

第二步：修改路径

bam2hints Makefile

# 先进入到augustus的解压目录
cd ~/Application/augustus-3.2.3/auxprogs/bam2hints
vim Makefile

# ====== 修改下列值 =====

# 原始
INCLUDES = /usr/include/bamtools
# 修改
INCLUDES = $(BAMTOOLS)/include/bamtools

# 原始
LIBS = -lbamtools -lz
# 修改
LIBS = $(BAMTOOLS)/lib64/libbamtools.a -lz

filterBam Makefile

cd ~/Application/augustus-3.2.3/auxprogs/filterBam/src/
vim Makefile

# ====== 修改下列值 =====

# 原始
BAMTOOLS = /usr/include/bamtools
# 修改
# BAMTOOLS = /usr/include/bamtools

# 原始
INCLUDES = -I$(BAMTOOLS) -Iheaders -I./bamtools
# 修改
INCLUDES = -I$(BAMTOOLS)/include/bamtools -Iheaders -I./bamtools

# 原始
LIBS = -lbamtools -lz
# 修改
LIBS = $(BAMTOOLS)/lib64/libbamtools.a -lz

安装

make BAMTOOLS=$(which bamtools)

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------I`m a line ! Thanks !---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

参考链接：https://www.jianshu.com/p/5041460f7a5d

busco软件使用详解

BUSCO - 组装质量评估软件

文献

说明

1. 下载与安装【方便】

1. 下载与安装【麻烦】

依赖的工具

下载

安装

2. 下载数据库文件

3. 配置

4. 导入环境变量

5. 运行

开始评估

6. 结果解读

7. 画图

参考

Augustus安装错误

解决方法

第一步：安装好bamtools

第二步：修改路径

安装

相关文章

网友评论

延伸阅读

深度阅读

栏目导航

热点阅读

生物信息分析

基因组组装