组织优化（TO, Tissue Optimization）实验，主要是用于检测样本是否适合进行空间转录实验，以及摸索最佳透化时间。
不同的组织类型以及切片厚度，对组织透化的时间均有影响只有确定最佳透化时间之后，才可以开始空间基因表达的正式实验。
一、实验概况
在样本准备好并放置在TO slide上后，整个实验大约3个小时。
二、玻片介绍
TO Slide上有8个捕获区，8X8mm，oligo上包括poly(dT)捕获到mRNA，不包括spatial barcode，不构建文库，** 每一个组织用一张玻片**。
Tips
- 试剂保存在适合的条件下，RT的Mix需要放置在冰上使用；
- 包括组织的Slide，只能在-80℃中保存4周；
- 操作过程中，Slide正面朝上，不要触碰组织；
- 卡夹在使用前，可以使用普通的玻片进行练习；
- 成像前为了放置荧光淬灭，可以先用Test Slide进行设置参数；
- 操作前，避免引入气泡；
- 样本冷冻、包埋以及切片，需要严格按照protocol建议的完成。
三、透化及荧光cDNA合成
固定和染色后的样本，采用不同的时间，进行透化处理，然后捕获mRNA，用带有荧光的核苷酸进行反转录合成cDNA。
Tips
- 透化所用酶以及试剂在室温平衡，不同的试剂平衡时间不同。如Permeabilization Enzyme 15min，不超过20min；Switch Oligo室温平衡30min；
- 透化过程中，避免蒸发，使用Slide Seal覆盖Slide Cassette；
- 关于透化时间，建议0-30min内。其中一个捕获区，为阳性对照，加2 ulRNA（1ug/ul）。另一个捕获区，不进行透化处理，不加透化酶。不同的样本透化时间的设置可以不同，如果一次没有完全找到适合的透化时间，需要进行第二次。
四、组织移除及成像
组织经酶处理，移除后只剩下带有荧光标记的cDNA，然后成像，一次成像包括8个捕获区。
对比H&E和荧光成像，选择荧光信号最强、RNA扩散最少、内部组织结构最清晰的时间点，作为最佳透化时间点。如果两个时间点差不多，选时间长的。
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