CD161（KLRB1）这个基因目前发了4篇单基因泛癌生信。说明只要是好的基因，分析的侧重点不同，仍然是可以发多篇文章的！
之前小编写过生信筛选的单基因如何补充实验
小编一直觉得单基因泛癌的文章进可攻（纯生信发文）退可守（补实验）。小编已经有不少客户发了单基因生信文章后，开始做实验进行深入研究，后续可以继续发文章写基金。比较老的客户已经成功拿到经费。
研究背景：
癌症免疫治疗在不同恶性肿瘤中显示出重要的临床疗效，越来越多的临床肿瘤学家将注意力转向了免疫肿瘤学。许多癌症患者接受了免疫治疗，其中免疫治疗药物可以抑制免疫检查点分子，这是促进肿瘤细胞免疫逃逸的介质。程序性死亡-1/程序性细胞死亡配体(PD1/PD-Ls)是最重要的免疫检查点。NK受体- P1aA(NKRP1A)，或杀手细胞凝集素样受体亚家族B成员1 (KLRB1)，是编码人类CD161的基因。杀手细胞凝集素样受体负责配体识别，并在细胞外区域包含C型凝集素样结构域。CD161通常在单核细胞、自然杀伤细胞(NK)、NKT细胞和25%的外周血t淋巴细胞中表达。一项新的研究表明，KLRB1基因失活或抗体介导的KLRB1阻断在体外增强了T细胞介导的胶质瘤细胞杀伤作用，在体内增强了其抗肿瘤功能。他们将CD161-CLEC2D通路定义为胶质瘤和其他人类癌症免疫治疗的潜在靶点。本研究整合并分析了CD161的表达、生存分析和单细胞测序。因此，全面分析CD161在人类癌症中的分布，有助于理解免疫细胞CD161在肿瘤免疫中的固有作用及其在恶性肿瘤靶向治疗中的应用前景。
研究结果：
一、CD161的泛癌表达及甲基化分析
1、研究结构设计如下:大部分研究基于33癌症基因组图谱(TCGA)。
2、使用TCGA分析了CD161在多种人类癌症中的表达水平(图1A)，使用GEPIA分析了CD161的交互式体图(图1B)。
3、基于STRING的CD161相关蛋白蛋白相互作用网络(图1C)。
4、CD161在人红白血病细胞系HEL、慢性髓系白血病(CML)源性细胞系HAP1、人胎盘绒毛膜癌细胞系BeWo、人浆细胞瘤细胞系Karpas-707、胶质母细胞瘤细胞系U-138 MG、人造血细胞系U-937等细胞系中高表达(图1D)。
5、疾病网络相互作用分析显示，KLRB1具有多个与免疫系统疾病、测量、肌肉骨骼或结缔组织疾病、遗传、家族性或先天性疾病、泌尿系统疾病、传染病或感染后疾病相关的基因功能伙伴(图1E)。
6、使用GSCALite平台评估TCGA癌症中KLRB1及T细胞和巨噬细胞标记基因的甲基化特征(图1F, G)。在14种癌症类型中寻找正常组织和肿瘤组织DNA甲基化的差异。这一结果表明，KLRB1的甲基化在肝细胞癌(LIHC)、结肠腺癌(COAD)和前列腺腺癌(PRAD)中下降最为明显(图1F)。估算了33种癌症中KLRB1表达与DNA甲基化之间的关系;结果表明，KLRB1及T细胞、巨噬细胞标记基因的表达与DNA甲基化主要呈负相关，少数呈正相关(图1G)。
二、CD161表达与TCGA肿瘤患者预后的相关性
1、探讨了CD161 -高组和CD161 -低组在TCGA中33种癌症类型的OS和DSS方面的生存差异。
2、采用单因素cox回归分析探讨CD161对33种癌症类型的OS和DSS的预后价值。CD161在ESCA、LGG和UVM患者中的高表达与较短的OS显著相关。(图2A、B)
3、CD161低表达患者与较短的OS相关。ESCA、LGG和UVM患者CD161高表达与DSS短有显著相关性，这与OS分析的结果相似(图2C、D)。
三、CD161在不同组织中的突变分布
1、cBioPortal平台可以对TCGA数据库中的不同基因类型进行分析，利用该平台分析了CD161的突变频率。
2、使用cBioPortal检测TCGA数据库中CD161的突变频率(图3)。cBioPortal对单个基因进行了不同的可视化分析(图3A, B)。图3A显示了KLRB1 mRNA表达与其推测的copynumber改变(cna)之间的关系，图3B显示了KLRB1 mRNA表达与其起源之间的关系。
3、R28Q是最常见的突变位点;显示3例患者/样本42个突变中的3个(图3C)。
四、CD161在不同癌症类型中的CNVs和SNVs
1、拷贝数变异(CNV)和单核苷酸变异(SNV)使用GSCALite平台进行。预测了不同类型的靶基因CNA，大多数CNVs为杂合扩增或缺失(图4A-C)。
2、图4C显示了每种癌症CD161与T细胞和巨噬细胞标记基因的杂合或纯合CNVs。TGCT、ACC、LUSC、OV、BLCA、USC、ESCA、LUAD、SKSM、SARC和KICH被认为表现为杂合扩增或缺失型CNA。
3、在mRNA表达与CNV的相关性中，TCGA、OV、ESCA、HNSC、LUSC、SKCM与KLRB1的表达呈负相关(图4D)。
4、在泛癌分析中，CD161和T细胞、巨噬细胞标记基因最常见的DNA改变为错义突变(图4E)。
五、CD161与人类癌症中新抗原数量的关系
1、新抗原加载可能在癌症免疫治疗中形成生物标志物，并为开发选择性增强T细胞对这些抗原反应性的新疗法提供动力。因此，探索了CD161与人类TCGA癌症中新抗原数量之间的关系。
2、数据显示，基于SangerBox (http://sangerbox.com)的新抗原数量与GBM、LUSC、COAD和CESC中CD161的增加显著相关。
六、CD161的药敏分析及途径富集
1、使用GSCALite进行33例肿瘤中CD161和T细胞、巨噬细胞标记基因的药敏分析和通路富集。这些基因通路主要与上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)、细胞凋亡的激活以及激素AR和ER的抑制有关(图5A, B)。
2、基于基因集变异分析(gene Set Variation analysis, GSVA)算法的通路富集分析显示，CD161在BRCA、BLCA、CESC、GBM、COAD、KIRC、HNSC、LIHC、KIRP、LGG、LUSC、LUAD、OV、READ、PRAD、STAD、SKCM、THYM、THCA、UCEC等多种免疫相关通路中均有活性(图5C)。
七、单细胞测序揭示CD161在肿瘤和免疫细胞中的表达
1、基于r包copykat，研究了几种肿瘤类型中CD161在肿瘤和免疫细胞中的表达水平。在LIHC中，CD161主要表达于T细胞、胸腺上皮细胞(TEC)、B细胞、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)，成纤维细胞，造血祖细胞(HPC样)和癌细胞。
2、在SKCM中，CD161在B细胞、T细胞、NK细胞中表达度最高(图6A)。
八、癌细胞和T细胞表现高CD161在SKCM scRNA-Seq中的表达
1、分析了SKCM中癌细胞和T细胞的功能注释和单细胞伪时间轨迹。在癌细胞中，Monocle重构了一条轨迹，主要包括两个分支点(代表1和2)，并将细胞分为四种状态(图6B)。
2、在T细胞中，Monocle重建了包括6个分支点(记为1到6)的轨迹，并将细胞分为15个状态(图6C)。
3、结果显示癌细胞和T细胞中各状态KLRB1的基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis, GSEA)(图6D, E)。
九、CD161高表达和低表达T细胞的细胞间通讯
1、点状图分别显示了九种细胞类型在接收者和发送者之间的通信模式(图7A, B)。
2、阐明了CD161表达与特定信号通路之间的相关性。结果显示，CD161高表达的T细胞通过ANGPTL、BMP、EGF、FGF、SEMAS、WNT等信号通路与癌细胞密切相互作用(图7C-H)。
十、CD161表达与巨噬细胞和T细胞的相关性
1、利用泛癌样本的组织芯片来探索CD161在巨噬细胞和T细胞中的表达谱。选择CD68、CD163和CD8作为巨噬细胞、M2巨噬细胞标记和T细胞标记。免疫荧光显示甲状腺乳头状癌(PTC)和滤泡型甲状腺乳头状癌(FV-PTC)比正常组织表达更多CD161(图8A)。
2、结果显示，CD161在WHO II胶质瘤中的表达水平明显低于WHO III胶质瘤(图8C)。
3、GBM显示的CD161水平高于LGG，且在M2巨噬细胞中，GBM显著表达(图8B)。
4、CD161在喉鳞癌(LSCC)(图8D)、CESC(图8E)、UCEC(图8F)、TGCT(图8L)中的表达高于正常组织。
5、CD161在上路尿路上皮癌(UTUC)和微乳头状尿路上皮癌(MPUC;图8G)、BLCA(图8H)和阴茎鳞状细胞癌(PSCC;图8I)。
6、比较了CD161在OV和卵巢乳头状腺癌(OPV)中的表达，发现CD161主要在T细胞中表达(图8J)。
7、与Gleason评分较低的PRAD患者相比，Gleason评分较高的PRAD患者CD161表达上调(图8K)。
十一、免疫治疗对CD161高的患者更为实用
1、使用ROC曲线下面积(AUC)作为预测质量的衡量标准。结果显示，在25个免疫治疗队列中，单独CD161的预测价值在4个队列中的AUC(图9A)。
2、不同ICB处理如何刺激KLRB1基因在不同模型中的表达(图9B)。在ICB应答者中，KLRB1表达水平在B16、CT26、D3UV2、KPB25L和MOC22模型中显著上调。
3、分析了CD161在尿路上皮癌抗pd -1队列(Imvigor 210)、非小细胞肺癌抗pd -1队列(GSE136961)和GBM队列中的预测价值。在Imvigor 210队列中，患者的高危评分与较长的OS显著相关(图9C)。
4、与低CD161组相比，高CD161组也证实了PD-L1免疫治疗的显著治疗强度和反应(图9D)。高危评分组CD274水平较高(图9E)。
5、在GSE136961队列中，高危评分组患者OS和PFS延长(图9F, G)。
6、具有持久临床获益的患者组KLRB1表达水平明显高于无临床获益的患者组(图9H)。
7、在GBM队列中，高危评分患者的OS短于低危评分患者，但差异无统计学意义(图9I)。
8、在GSE78220队列中，CD161高表达在CR、PD和PR组中的比例分别为57.39%、80.95%和67.5%(图9J)。
9、高CD161组CD274表达增加，导致对免疫治疗的合理反应(图9K)。
十二、基于SKCM的scRNASeq预测转录因子的生物学功能
1、构建了一个基因调控系统，以挖掘CD161在肿瘤细胞中的表达与转录因子之间的关系。根据连接特异性指数将恶性细胞分为4个模块，其中M2和M4观察到更多的规则(图10A)。
2、探讨了四个恶性细胞模块中调控因子分布与CD161表达的相互关系(图10B, C)。结果显示CD161高组在所有模块中调控因子活性和计数均较高，模块2与模块4之间差异显著。
3、根据排名最高的调控因子进行GO和KEGG富集分析，结果显示这些调控因子与T细胞活化过程高度相关(图10D, F)。
4、高CD161表达的肿瘤细胞中主要特异性调控因子包括RORA_extended、MYC、MAFF_ extended、XBP1、MXD4_ extended、KLF8_ extended、STAT4_ extended，而低CD161表达的肿瘤细胞中主要特异性调控因子包括EOMES_ extended、IRF8、STAT3_extended、NUAK2_ extended, NFATC1, IRF4_ extended和NFIL3_ extended(图10E)
总结：研究结果表明CD161的表达与各种癌症的发生发展密切相关。越来越多的证据表明，适当剂量的化疗联合免疫检查点抑制剂(ICIs)比单一治疗更有效。评估了33例TCGA肿瘤中CD161的表达水平;发现泛癌CD161在肿瘤组织和正常组织中的表达有明显差异。对CD161的异常表达、甲基化和预后进行了泛癌分析。研究在单细胞测序水平和转录因子预测方面更多地探索了CD161在黑色素瘤肿瘤微环境中的潜在作用。
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