真核生物mRNA测序

一、真核生物mRNA的结构：

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二、建库方式：
真核生物mRNA含有poly-A尾，因此最常用的富集真核生物mRNA的方法就是采用附着poly-T oligo的磁珠从total RNA 中抓取mRNA。建库示意图如下图所示：
1、提取总RNA：提取总RNA后需要对其进行质量检查，包括纯度、浓度和完整性（RIN）。如果总RNA起始量太低，不能保证有足够的mRNA用于建库。另外RNA容易降解，而采用附着poly-T oligo的磁珠捕获降解后的RNA会产生3'偏好性，因此建议RIN值大于等于7。
2、mRNA捕获：真核生物的成熟mRNA带有poly-A尾，因此可以采用附着poly-T oligo的磁珠从总RNA中捕获mRNA。
3、mRNA片段化：
4、cDNA第一链合成：以mRNA为模板合成cDNA。
5、cDNA第二链合成：以cDNA第一链为模板合成cDNA第二链。
6、双链cDNA末端修复：3'加A，5'修复。
7、加接头：
8、PCR富集mRNA文库。
9、上机测序。

mRNA_lib.png

三、生信分析：
1、数据拆分：利用bcl2fastq软件将bcl文件转换成fastq文件。
2、数据预处理：有些测序reads可能包含测序接头、引物序列、低质量碱基、N含量较高，因此通常需要对测序数据进行预处理，去除这些不合格的碱基或reads。常用的软件有fastp，cutadpater以及Trimmonmatic等。
3、质控分析：对预处理后的数据进行质控分析，通常采用fastqc。
4、参考基因组比对：将测序数据与参考基因组进行比对，常用的比对软件有hisat2，tophat2，STAR等。
5、转录本的组装和定量：常用的软件有cufflinks，stringtie等。
6、差异分析：分析不同处理条件下基因或转录本的表达是否有差异，穿能够与的软件有DEseq2，edger，ballgown等。
7、富集分析：对差异基因进行富集分析，统计学原理是基于超几何分布。