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一文了解Count、FPKM、RPKM、TPM | 相互间的转化

一文了解Count、FPKM、RPKM、TPM | 相互间的转化

作者: 小杜的生信筆記 | 来源:发表于2022-01-22 15:43 被阅读0次

    PS:如果你需要本教程的练习代码和文档,可以在公众号回复“20220122”即可获得。


    前言:

    今早看到一篇博文,提到了FPKM与TPM间转化。我自己也系统的再次进行整理一下(PS:自己前期的基础不是很牢固,基本只是使用Count和FPKM,其它的表达丰度基本没涉及)。因此,本教程博文也是自己的一个学习笔记。也是结合很多篇博文组装出来的,记录记录!!!

    ---- Du


    •转录组使用hisat2比对后,我们会使用featureCounts、HTseq-count等软件计算每个基因Count值(每个基因比对上的reads数),count值是最原始的,也是最接近真实的基因表达情况,是没被标准化的数值,因此,很多的差异表达分析,输入文件(input data)使用Count值。以及,后面所有的FPK、RPKM、TPM等都是依据Count值转换出来的。

    •计算FPKM值,可以根据Count值进行计算,此步需要我们后期自己计算,但也是使用Stringtie软件进行计算。该软件也可以使用其脚本prepDE.py进行转化,由FPKM To Count,使用也是相对比较方便。详情到网址:StringTie (jhu.edu) - http://ccb.jhu.edu/software/stringtie/index.shtml?t=manual


    Count

    定义:高通量测序中比对到exon上的reads数。可以使用featureCounts、HTseq-count等软件进行计算。

    优点:可以有效说明该区域是否真的有表达及真实的表达丰度。能够近似呈现真实的表达情况。

    缺点:由于exon长度不同,难以进行不同exon丰度比较;由于测序总数不同,难以对不同测序样本间比较。


    FPKM

    FPKM: FPKM的全称为Fragments Per Kilobase Million,Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments(每千个碱基的转录每百万映射读取的fragments)。通俗讲,把比对到的某个基因的Fragment数目,除以基因的长度,其比值再除以所有基因的总长度。注意,这里的基因长度是指基因外显子的总长度。


    RPKM

    RPKM: Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads (每千个碱基的转录每百万映射读取的reads);

    FPKM与RPKM的区别

    RPKM通常用于单端测序,FPKM常用于双端测序

    如果是单端测序,那么一个fragmetns就对应了一条read,如下所示:

    如果是双端测序,那么一条fragments就对应两条reads,当然,有时候双端测序也有可能出现一条fragment对应一条read(另外一条read有可能会因为质量低而被剔除),FPKM就保证了,一条fragment的两条reads不会被统计2次,如下所示:

    FPKM是以fragment为准,而不是以reads数为准,它们的计算方式是一样的


    RPM

    定义:RPM/CPM: Reads/Counts of exon model per Million mapped reads (每百万映射读取的reads)

    公式:RPM = ExonMappedReads * 10^6 /TotalMappedReads

    优点:利于进行样本间比较。根据比对到基因组上的总reads count,进行标准化。即:不论比对到基因组上的总reads count是多少,都将总reads count标准化为10^6。sRNA_seq等测序长度较短的高通量测序经常采用RPM进行标准化,因为sRNA长度差异较小,18-35 nt较多,所以长度对不同的small RNAs相互比较影响较小 (优点:计算简单、方便。)。

    缺点:未消除exon长度造成的表达差异,难以进行样本内exon差异表达的比较。


    TPM

    定义:TPM的全称为Transcripts per million,Transcripts Per Kilobase of exon model per Million mapped reads (每千个碱基的转录每百万映射读取的Transcripts)

    解释:Ni为比对到第i个exon的reads数;Li为第i个exon的长度;sum(N1/L1+N2/L2 + ... + Nn/Ln)为所有 (n个)exon按长度进行标准化之后数值的和。


    获得gene外显子长度!

    library(GenomicFeatures)
    ## 导入gff3文件
    txdb <- makeTxDbFromGFF("ITAG4.1_gene_models.gff", format = "gff")
    ## 获取外显子位置
    exons_gene <- exonsBy(txdb, by = "gene")
    ## 去除外显子重叠部分,计算外显子长度
    exons_gene_len <- lapply(exons_gene,function(x){sum(width(reduce(x)))})
    exons_gene_len <- as.matrix(t(exons_gene_len))
    write.csv(exons_gene_len,"tomato_gene_length_4.1.csv", row.names = T)
    

    我使用番茄基因组4.1的注释文件,但是提取只得到100多个基因的外显子长度,不知道是哪一步出现问题。你可以使用你的物种注释文件操作一下。如果你会写编程,也是使用脚本进行提取,也是相对容易的循环就可以提取得到。


    Code | 各表达量间的转化

    countToTpm <- function(counts, effLen)
    {
    rate <- log(counts) - log(effLen)
    denom <- log(sum(exp(rate)))
    exp(rate - denom + log(1e6))
    }
    
    countToFpkm <- function(counts, effLen)
    {
    N <- sum(counts)
    exp( log(counts) + log(1e9) - log(effLen) - log(N) )
    }
    
    fpkmToTpm <- function(fpkm)
    {
    exp(log(fpkm) - log(sum(fpkm)) + log(1e6))
    }
    
    countToEffCounts <- function(counts, len, effLen)
    {
    counts * (len / effLen)
    }
    
    # An example
    ################################################################################
    cnts <- c(4250, 3300, 200, 1750, 50, 0)
    lens <- c(900, 1020, 2000, 770, 3000, 1777)
    countDf <- data.frame(count = cnts, length = lens)
    
    # assume a mean(FLD) = 203.7
    countDf$effLength <- countDf$length - 203.7 + 1
    countDf$tpm <- with(countDf, countToTpm(count, effLength))
    countDf$fpkm <- with(countDf, countToFpkm(count, effLength))
    with(countDf, all.equal(tpm, fpkmToTpm(fpkm)))
    countDf$effCounts <- with(countDf, countToEffCounts(count, length, effLength))
    

    参考:

    关于readsCount、RPKM/FPKM、RPM(CPM)、TPM的理解

    RNA-Seq的count、RPKM/FPKM、CPM、TPM的关系

    RPKM, FPKM and TPM, clearly explained | RNA-Seq Blog

    StatQuest学习笔记24——RPKM FPKM TPM

    如何优雅的统计基因外显子长度

    Htseq Count To Fpkm | KeepNotes blog


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