大家好，本周给大家分享的是2021年12月份发表在Current biology上与中国家马体型相关主效基因突变的一篇文章。
文章题目：A single-nucleotide mutation within the TBX3 enhancer increased body size in Chinese horses（TBX3增强子内的SNP增加了我国家马的体型）
期刊： Current Biology
影响因子： 2020_IF= 10.834; 中科大类: 生物 1区; JCR分区: Q1
发文单位：中国农科院北京畜牧兽医研究所, 法国图卢兹第三大学等5家单位。
文章作者：中国农科院Xuexue Liu为第一作者，蒋琳研究员为通讯作者。
摘要：中国矮种马为我国西南山区特有，先前的研究已经开始揭示西方矮马和普通马体型变异的遗传基础，发现HMGA2、LCORL/NCAPG、ZFAT和LASP1这些基因座。同样的遗传途径是否会导致中国矮种马的体型变小目前尚不清楚。为了验证这一点，作者利用中国187份中国马的种质资源，分析表明T-box转录因子3（TBX3）的遗传变异与体型之间存在高度关联。对189份中国矮种马和574份中国家马群体进行的精细定位分析将关联缩小到TBX3上游增强子区域的一个A/G SNP（ECA8:20644555）。荧光素酶分析证实单核苷酸G突变可以上调TBX3表达，增强子敲除小鼠的四肢明显比野生型同窝小鼠短。对古马群体DNA数据的分析表明，现代家马中最常见的G等位基因最早出现在约2300年前，此后其频率不断上升。这与大约从秦国时期由于对战马的需求加速了对大型中国家马选育一致。总的来说，这项研究描述了中国矮种马体型小背后的遗传机制，并揭示了过去中国家马育种家的主要选择目标之一是马的体型。
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主要结果：
1、中国家马和矮种马之间的选择信号和全基因组关联分析
作者使用Fst, 核酸多样性和XP-EHH三种方法鉴定中国矮种马和中国家马的正向选择信号。作者共鉴定了153个窗口，包括4.66 Mb和69个蛋白质编码基因（图1A）。这些候选区间在中国家马显示出有限的遗传多样性，但在矮种马上没有，这表明中国家马受到了正选择（图1A）。重要的是, 包含最强选择信号的四个异常基因组区域均包含TBX3（图1A），并进一步细化为80kb区域（ECA8:20640000–20740000bp）（图1B）。另外作者对152份中国家马的体高进行全基因组关联分析，鉴定了两个显著性区域，包含82个SNPs（图1C）。第一个区域跨越TBX3/TBX5基因座，第二个区域包含HMGA2基因座，这一结果表明TBX3、TBX5和/或HMGA2可能揭示了中国矮种马的遗传基础。同时发现伊犁马的TBX3在胎盘表达也比NiQi矮种马高4.3倍（图1E），表明TBX3表达水平与成年马体高呈正相关。这一发现与TBX3区域中没有错义突变以及在中国家马的该区域中发现的较低的核苷酸多样性和Tajima's D统计一致（图1B）。这表明TBX3区域内存在的遗传变异可以调节基因表达，并可能导致中国家马和矮种马的体型差异。作者利用单倍型区块分析了该区域的连锁不平衡（LD），揭示了包含16个候选SNP的9个区块（H1-H9）,在H2中包含2个SNPs （TBX3-EN1和TBX3-EN2）（图1F）, 表明TBX3-EN1和TBX3-EN2单核苷酸多态性可能调节了TBX3的表达。
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图1. 全基因组统计分析。（A）“矮种马”组和“中国家马”组中的选择信号分析。Fst分析(x轴)，核酸多样性比值（y轴），XPEHH分析（颜色）。（B）沿着TBX3区域基因组扫描。在顶部面板中提供了矮种马（红）和中国家马（黑色）的核苷酸多样性值，而Tjjima’ D和Fst值显示在中间和底部面板中。(C) 中国矮种马（N=52）和中国家马（N=100）体高性状的全基因组关联研究（GWAS）的曼哈顿图。（D）QQ图。（E）三匹NiQi小马（灰色）和四匹伊犁马（黑色）的的胎盘中TBX3、TBX5和HMGA2的FPKM值。(F) TBX3位点的单倍型区块分析。
2、鉴定TBX3致病变异体
卡方检验证实了与马体高的强统计关联性，TBX3-EN2（p=2.34e-39）比TBX3-EN1（p=8.18e-29）更强（图2）。关联模型表明TBX3-EN2（TBX3-EN1）处的变化可以解释该群体中体高变化（～10 cm）的～20.3%（～15.1%）（图2A）。在藏马中发现了中等等位基因频率（67.2%–87.5%），显示了中等的马的体高（125–135厘米）（图2A）。这证实了在该模型中，A变异体可以代表TBX3-EN2的祖先等位基因，并且衍生的G等位基因在中国家马中的频率增加，以响应更高体高的选择。TBX3-EN1的遗传变异分布表明T等位基因可能存在类似的情况。
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图2. 更大马群的基因分型。TBX3-EN1和TBX3-EN2在总共763份马的种质资源中进行基因分型，这些马包括7个矮种马品种（N=189）、1个普氏马品种（N=13）和18个中国家马品种（N=561）。（A）TBX3-EN2（ECA8:20644555）位点的等位基因频率。A等位基因为蓝色，G等位基因为橙色。(B) TBX3-EN1（ECA8:20644525）位点（左y轴）的等位基因频率。C等位基因为蓝色，T等位基因为橙色。TBX3-EN2（p=2.34e-39）和TBX3-EN1（p=8.18e-29）与马的体高（右y轴）表现出强烈的相关性，分别解释了20.27%和15.05%的表型变异。黄色和绿色的条纹代表矮种马和中国家马的品种。
3、重建TBX3-EN1和TBX3-EN2衍生等位基因的频率轨迹
作者利用了之前发布的古马基因组序列进一步重建了过去～6000年中TBX3-EN1和TBX3-EN2衍生等位基因的频率轨迹。研究发现在大约2300 年前，大多数古马样本携带TBX3-EN2的A等位基因，在此之后，G等位基因频率稳步增加（图3A和3B）。然而此处重建的等位基因轨迹与死后DNA损伤水平无关（图3B）。作者分析支持了TBX3-EN2 G等位基因和TBX3-EN1 T等位基因的选择，这两个等位基因与都马体高增加有关（图3B）。此外，包含TBX3-EN1和TBX3-EN2的TBX3增强子两侧10 kb区域内245份古马的基因分型谱与中国矮种马（N=52）中发现的基因分型谱更接近于中国家马（N=100）（图3C）。现代中国家马的特征是有限的序列变异，这与该区域的正选择一致。
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图3. 古马样本中TBX3-EN2处A/G SNP的等位基因频率。（A）考古遗址的位置。灰色和橙色分别代表TBX3-EN2位点的A和G等位基因。红色圆圈显示了G等位基因~2300 年前在哈萨克斯坦Berel最早出现的时间。（B）TBX3的等位基因时间轨迹（TBX3-EN1，ECA8:20644525；TBX3-EN2，ECA8:20644555）。(C) 热图总结了现代和古代马TBX3基因座上游和下游约10 kb的基因型。红色、灰色和白色线分别表示纯合（AA）、杂合（AG）和纯合（GG）基因型。紫色、黄色和绿色竖条分别描绘了古代马、现代矮种马和马。
4、TBX3致病变异体的功能验证
基于古代和现代基因组数据的分析支持了TBX3-EN1的T突变和TBX3-EN2的G突变的选择可能在过去2300年中增加了中国马的体型。HEK293T细胞中的双荧光素酶实验分析表明，携带TBX3-EN1和TBX3-EN2（T和G）衍生等位基因的载体与仅携带TBX3-EN2衍生等位基因的载体之间的表达水平没有显著差异（C和G；图4A）。为了进一步验证TBX3突变的后果，作者利用CRISPR/Cas9技术构建了TBX3增强子敲除（KO）小鼠（图4B）。相对于WT，TBX3增强子-/-小鼠的TBX3前肢转录减少了6倍（p=0.004）。在胚胎和2周的腿骨中也检测到类似的TBX3转录水平降低（p<0.05）（图4C）。另外作者在11周和2周的小鼠身上使用micro-CT和X射线成像技术来测量参与肢体形成的所有骨结构的长度(图4D-F)。有趣的是，前肢的尺寸缩小比后肢更为明显，尤其是在2周龄的雌性小鼠中，第三和第四掌指的尺寸缩小几乎达到20%（图4E）。
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图4. 细胞和小鼠模型的功能验证。（A）双荧光素酶报告试验。(B) TBX3增强子KO小鼠的构建和PCR验证。（C）第0天WT（绿色）、KO+/-（灰色）和KO-/-（黄色）小鼠趾骨中TBX3 mRNA的表达。（D）小鼠前肢和后肢的X射线图像。（E）2周龄含TBX3增强子的KO-/-和WT小鼠的掌骨长度。（F）11周龄含TBX3增强子的KO-/-和WT小鼠的掌骨长度
作者在这项研究中，使用全基因组序列数据来确定中国家马和中国矮种马品种之间存在显著差异的候选区域。总之，该研究表明TBX3的表达在中国家马和矮种马的体型变异中起着关键作用。
文中所有图片均来自A single-nucleotide mutation within the TBX3 enhancer increased body size in Chinese horses
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文章链接地址：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960982221016110?via%3Dihub
参考文献：
Liu X, Zhang Y, Liu W, et al. A single-nucleotide mutation within the TBX3 enhancer increased body size in Chinese horses[J]. Current Biology, 2021.
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