本文选自JOURNAL OF EXTRACELLULAR VESICLES，https://doi.org/10.1080/20013078.2020.1746529，喜欢的朋友可以自行下载阅读。
这是一本创刊就是11分的神刊，看看都收录了什么妖魔鬼怪。二话不说，先上图。
作者上来就从淋巴管生成入手，淋巴管生成是癌细胞淋巴浸润和转移的重要过程。应用转基因鼠进行研究，发现主要淋巴管生成因子VEGF-c在KPC胰腺肿瘤区的连续切片中的表达也增加。胰腺癌细胞系很多，作者进一步看了看不同细胞系VEGF-C的表达情况，发现MIA Paca-2细胞内源性VEGF-C的表达水平最高，作者进一步用Size exclusion chromatography证明了外泌体标记物增多时VEGF-c也增多了，提示VEGF-c是通过外泌体转移出细胞外的。
那么外源性的VEGF-C增多是不是由于内源性的增多因其的呢，作者应用课低表达VEGF-C的细胞系构成性表达内源性VEGF-C,然后用外泌体抑制剂再次测定外泌体提取的VEGF-C的变化情况，得到了一致性结果。
那么淋巴内皮细胞会不会摄取EV呢，作者进一步用免疫荧光验证了一下。然后检测了不同处理组ki-67，显示内皮细胞的增殖在EV处理后更加活跃。
以上在细胞水平说明了VEGF-C可以进入EV，并且被淋巴内皮摄取发挥功能。作者既往研究已经证明，MAPK的特异性磷酸酶DUSP2在许多实体肿瘤中表达下调，导致ERK的激活时间延长和血管生成基因的异常表达，作者进行了一波测序，发现DUSP2调节的基因表达与胰腺肿瘤、血管生成和VEGF-C表达相关，在oncomine上也发现PDAC中DUSP2mRNA的表达减少，应用免疫组织化学方法对54例胰腺肿瘤标本进行了DUSP2的免疫组织化学染色，观察到非肿瘤成分(箭头)局部DUSP2阳性，而胰腺上皮内瘤变(Panin)和胰腺癌(Ca)缺乏DUSP2表达，与DUSP2是一种ERK特异性磷酸酶的观点一致，免疫组织化学染色显示ERK在KPC小鼠的肿瘤区域被激活。为了验证DUSP2的缺失是否影响VEGF-C的表达，针对DUSP2的shRNA被用来在PANC-1细胞(表达更高水平的内源性DUSP2)中敲除DUSP2。结果显示，DUSP2基因敲除引起ERK磷酸化和VEGF-C。
这里可以看到DUSP2和ERK的负相关性，以及ERK与VEGF-C的正相关性，VEGF-C位于下游，但是上游ERK和DUSP2谁调控了谁呢？作者下一步进一步在高表达DUSP2的细胞系PANC-1中敲减DUSP2，可见ERK和VEGF-C的相应改变，以此验证了DUSP2位于上游调控位点。然后用ERK的抑制剂发现VEGF-C下调，作者进一步验证了DUSP2与VEGF-C的负相关是在器官中普遍存在的。
这个粉粉的图一开始我还以为什么高大上的方法，后来想想这不是李春红染得色吗
既然作者体外证明了胰腺癌细胞CM可以促进LEC的增殖，可以被lenvatinib抑制
作者进行了一种异种移植小鼠模型来研究DUSP2缺失对肿瘤生长和淋巴管生成的影响。在异种移植动物模型中，DUSP2基因敲除导致更大的肿瘤大小和更多的淋巴管生成，为了进一步确定DUSP2-KD在胰腺癌进展中的体内作用，我们对SCID小鼠进行了对照细胞和DUSP2-KD PANC-1细胞的原位注射。接种后2个月处死动物(模拟PDAC早期)，收集肿瘤和胰腺。在对照组和DUSP2-KD肿瘤中，原发肿瘤的大小没有明显差异
肿瘤连续切片显示CD31和LYVE-1染色不重叠。有趣的是，DUSP2-KD肿瘤的淋巴管(LYVE-1阳性)明显增加，而微血管(CD31阳性)的数量很少，没有显著差异。抑制DUSP2可能通过VEGF-C依赖的方式促进胰腺癌细胞淋巴管生成和淋巴管侵袭能力。
虽然在早期未检测到胰腺癌的增加，但是，DUSP2-KD并未增加肿瘤的数量，但是可以增加淋巴管的数量，在小鼠胰腺中产生了Dusp2条件基因敲除(KO)。虽然Dusp2KO本身不足以诱导肿瘤的形成，但与野生型小鼠相比，Dusp2KO胰腺中可以检测到更多的淋巴管生成(在小叶内导管区域)。然后作者产生了Kras活性和Dusp2缺失(KDC)小鼠。在第7个月，KDC小鼠不仅发生了胰腺癌，而且显著增加了新形成的淋巴管，这一现象与在KPC小鼠中观察到的现象相似。此外，从KDC小鼠血清中分离的EV中检测到VEGF-C升高
作者下面又做了DUSP2的功能学实验
但是，这种功能是通过VEGF-C介导的吗，作者进一步验证了VEGF-C 以及受体VEGFR3和辅助受体Neuropilin 2，显示在胰腺癌中有自分泌功能。然后过表达VEGF-C可以起到和DUSP-KD相似的效果。
最后，作者使用了跨内皮细胞迁移实验来模拟渗出的真实情况。我们发现DUSP2-KD细胞也表现出增强的跨内皮迁移能力，该能力可被Lenvatinib阻断。
本文看似有一条轴线，但是这条轴线都没有显示出直接的联系，那么作者进一步研究了DUSP2是如何调控VEGF-C的表达的。作者发现在DUSP2-KD后VEGF-C mRNA增加了两倍，但是蛋白水平增加了10倍，可见，有其他方式调控VEGF-C的表达，作者进一步猜测mRNA稳定性是否有助于蛋白的表达，在是mRNA转录后修饰，用放线菌素D阻断基因转录，发现对照组和DUSP2-KD细胞VEGF-C mRNA的半衰期相当(补充图6)，提示mRNA稳定性不是VEGF-C蛋白增加的一个因素，提示mRNA稳定性不是VEGF-C蛋白增加的一个因素。VEGF-C被合成为前蛋白(59kD)，信号肽的去除和随后的蛋白水解产生了VEGF-C的功能形式，推测VEGFC加工的调控是导致VEGF-C显著升高的主要因素。研究显示，DUSP2-KD细胞条件培养液中成熟VEGF-C(30kD)明显增加。然而，也观察到在对照组中逐渐积聚，这表明VEGF-C在DUSP2-KD细胞中的处理速度更快。为了研究VEGF-C的制备过程，用放线菌酮处理AsPC1VEGF-C细胞，以确定VEGF-C前体、前体VEGF-C和成熟VEGF-C的大小。用布雷菲尔丁A(BFA，一种阻止蛋白质从内质网运输到高尔基体的化合物)处理显著减少了细胞裂解物和条件培养液中VEGF-C的成熟形式，同时导致细胞内前VEGF-C和ProVEGF-C的积累，表明蛋白质切割可能是DUSP2调节VEGF-C分泌的关键步骤。
为了研究DUSP2如何影响VEGF-C的加工，首先检测了原蛋白转化酶的表达，这些酶已经被证明可以加工VEGFC。然而，在对照组和DUSP2-KD细胞中，Furin、PC5/6和PCSK7的表达水平相似。然后，检测了总的原蛋白转化酶活性，发现DUSP2-KD细胞的活性要高得多。用不可逆的、细胞透性的竞争性抑制剂处理DUSP2-KD细胞，成功地抑制了原蛋白转化酶的活性，并显著减少了成熟形式VEGF-C(30kD)的产生。DUSP2-KD细胞用原蛋白转换酶抑制剂预处理可降低细胞侵袭能力，加入重组VEGFC可挽救这一作用。
综上所述，这些数据表明DUSP2主要通过调节原蛋白转化酶活性在翻译后水平调控VEGF-C的表达。但是DUSP2是否也调节了蛋白装载入外泌体中呢，作者进一步探讨了此项内容。从对照和DUSP2-KD细胞分离的EV显示，DUSP2-KD细胞的EV中VEGF-C增加，这可以被ERK抑制剂抑制。
为了进一步研究VEGF-C分泌的细胞过程，将编码VEGF-C-SNAP融合蛋白的质粒(VE-SNAP)瞬时转染细胞以观察VEGF-C颗粒的转运。免疫荧光成像显示VE-SNAP信号在细胞内的囊泡状斑点中检测到(补充图8B。此外，在从不同胰腺癌细胞分离的EV中分别检测到VE-SNAP(外源性VEGF-C)和内源性成熟VEGF-C(30kD)。我们观察到，与对照细胞相比，DUSP2-KD细胞的分泌样囊泡中可以检测到VE-SNAP信号，呈现出更加分散的模式。通过透射电镜进一步证实DUSP2-KD细胞分泌的VEGF-C与EV有关。VEGF-C与靠近质膜的双膜分泌囊泡有关。这些数据表明VEGF-C可以通过EV分泌，并受DUSP2的调节。有趣的是，作者还观察到DUPS2-KD细胞比对照细胞有更多的EVS。
红色箭头是免疫金染色的vegf-c，秒啊！！
作者会不会做一下外泌体内蛋白含量否改变的实验
作者进一步追踪了分泌囊泡的运动情况，发现DUSP2-KD囊泡运动的更快了。CMV驱动的VE-SNAP在细胞内稳定表达，应用原蛋白转换酶抑制剂观察DUSP2对EV-VEGF-C分泌速率的影响。时程检测显示DUSP2-KD细胞EV-VEGF-C的分泌率比对照细胞高。最后，作者证明来自DUSP2-KD细胞的EV与对照PBS治疗相比促进了PANC-1肿瘤中淋巴管的生成(图6(H)。共同证明了DUSP2基因敲除能促进EV-VEGF-C的分泌。
这个图有点秀！！
全文结束，只能说文章还是挺有深度的，机制部分做的很好，没有凑图的情况发生，介绍一些新的方法，值得学习、借鉴，欢迎各位老师批评、指正。
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