今天一起来看看发表于Cell Stem Cell期刊的关于DNA甲基化在克隆胚胎发育中的作用研究成果，本文研究了小鼠克隆胚胎早期着床前发育过程中DNA甲基化修饰的重编程过程，并揭示了异常DNA再甲基化（DNA re-methylation）是导致克隆胚胎着床后发育异常的关键因素。
标题：Inhibition ofaberrant DNA re-methylation improves post-implantation development of somaticcell nuclear transfer embryos
期刊：Cell Stem Cell（来自Cell出版社，在国际细胞生物学领域发表原创论文的147种核心期刊中排名第14，是一本涵盖生命、生物学、和医学领域的综合性论坛）
2021影响因子: IF 24.633/Q1
发表时间：2018.08.23
关键词：体细胞核移植、表观遗传重编程、DNA再甲基化、DNA甲基转移酶、组蛋白修饰
技术平台： 微量细胞全基因组重亚硫酸盐测序（scWGBS）、RNA-seq
关于scWGBS
单细胞及微量样本的DNA甲基化组学研究很大程度上受制于建库测序技术。传统的文库构建方法或类似于基因组DNA的单细胞扩增技术很难应用到甲基化实验过程中。易基因建立了基于线性扩增和单管建库的技术，可充分降低文库偏好性，准确的完成珍贵样本的全基因组甲基化研究。
单细胞及微量珍稀样本的甲基化研究主要应用于肿瘤发生机制，癌症研究，胚胎植入前诊断，胚胎早期发育，生殖细胞重组，干细胞及细胞异质性等研究领域。应用的样本包括单细胞、微量细胞等。
研究目的
体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer，SCNT）又称体细胞克隆，是指将供体细胞核经显微操作移入去核的卵母细胞中，组成重构胚胎并使之发育成新个体的技术。SCNT使体细胞的基因组重新编程为全能状态，从而可以生成克隆动物和核移植胚胎干细胞（ntESCs）。因此，SCNT技术为畜牧业和人治疗性克隆带来了巨大的希望。但核移植胚胎和正常受精胚胎相比，发育率仍然极低。此前的研究陆续揭示了导致克隆效率低下的多种表观遗传障碍及解决办法，这些研究成果促进了灵长类动物克隆的突破。然而，克隆胚胎中DNA甲基化的重编程过程及其对克隆效率的影响在很大程度上还是未知的。
因此，本文研究人员通过胚胎活检系统和微量细胞全基因组重亚硫酸盐测序（scWGBS）技术，验证DNA甲基化的重编程在SCNT胚胎中的作用。
项目设计
（1）样本选取：
实验选择8-10周龄的B6D2F1（C57BL / 6雌性×DBA2雄性）雌性小鼠用作卵母细胞受体。从B6D2F1小鼠中收集积液细胞（雌性）和sertoli细胞（雄性）。从C57BL / 6小鼠胚胎中以13.5 dpc建立小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），对来自ICR株的9-15周龄的雌性小鼠进行胚胎移植。
（2）项目设计流程图：
实验结果
（1）不同发育潜力SCNT胚胎之间的DNA甲基化
研究人员利用微量细胞全基因组重亚硫酸盐测序（scWGBS）技术，绘制了不同细胞发育命运的克隆胚胎植入前发育过程中的全基因组、单碱基分辨率DNA甲基化图谱。得到了供体卵丘细胞到囊胚期的SCNT胚胎的WGBS数据，将其与此前研究中受精胚胎的WGBS数据进行对比，结果发现SCNT 胚胎组中呈现全基因组超 DNA 甲基化模式，表明不完全的DNA去甲基化可能与SCNT胚胎的发育阻滞有密切的关系。此外，研究人员在胚泡期内部细胞团（ICM）和滋养外胚层（TE）样品中识别出数千个区域的异常变化，这可能是降低SCNT植入成功率的重要原因。数据表明，DNA甲基化受损可能是植入前SCNT胚胎不可避免的障碍。
（2）SCNT胚胎中发生异常的DNA再甲基化
与正常的受精胚胎组发育过程不同，SCNT胚胎组显示出异常的甲基化水平升高现象。为了探索SCNT胚胎的潜在分子机制，研究人员通过对比SCNT胚胎组与受精胚胎组之间的差异甲基化区域（DMR），鉴定出了广泛的再甲基化位点（rDMR），且这一再甲基化现象在发育阻滞的克隆胚胎中更明显。总体而言，以上结果提高了SCNT胚胎基因组中rDMR发挥明显障碍作用的可能性，适当敲除rDMR可以挽救卵裂阶段的发育阻滞，并促进胚泡发育。
（3）SCNT胚胎的超甲基化导致转录组障碍
通过对SCNT胚胎的转录组和 DNA甲基化组数据基于加权基因共表达网络分析（WGCNA），发现与受精胚胎组相比，SCNT胚胎组中异常的DNA超甲基化，特别是再甲基化，可以通过调节关键的发育基因来促进SCNT胚胎的发育能力，而某些反转录转座子更有可能对去甲基化有抵抗力，并且可能在克隆胚胎中体细胞的表观遗传背景下受到保护。
（4）抑制DNA再甲基化可促进SCNT胚胎的发育
在不完全再甲基化与SCNT胚胎发育失败之间建立了相关性之后，研究人员对抑制再甲基化是否可以改善克隆动物不良发育进行了分析，探讨了DNA甲基转移酶 (Dnmts)对早期克隆过程中全基因组再甲基化模式的影响。结果表明，通过干扰Dnmts的表达可以有效降低克隆胚胎中异常的DNA再甲基化水平，激活克隆胚胎的特定转录本，并改进克隆胚胎的体内外发育效率。
（5）DNA修饰和组蛋白修饰剂的组合处理可实现更高的克隆效率
最后，研究人员探索了DNA修饰和组蛋白修饰的组合处理对异常DNA甲基化标记丢失后的影响，结果发现克隆胚胎的异常DNA再甲基化和组蛋白修饰重编程缺陷是两个相对独立的障碍，表明多种表观遗传调节剂的组合处理可能是实现更高克隆效率最有希望的方法之一。
关键图形
Figure 1. Aberrant DNA Re-methylation Occurs in SCNT Embryos
Figure 2. Hyper-methylation of SCNT Embryos Leads
to Dysregulated Transcriptional Activities
Figure 3. Knockdown of Dnmts Alleviates DNA
Re-methylation and Improves the Development of SCNT Embryos
Figure 4. Combined Approaches Achieve Higher
Cloning Efficiency
易基因小结
在本研究中，研究人员对小鼠SCNT 胚胎进行微量细胞全基因组重亚硫酸盐测序（scWGBS）分析，并对SCNT胚胎的转录组和 DNA甲基化组数据进行WGCNA分析，得出以下结论：
• 全基因组DNA甲基化图谱揭示了植入前 SCNT 胚胎中的异常DNA 再甲基化现象
• DNA再甲基化破坏了 SCNT 胚胎中正常合子基因组的激活0
• 敲除Dnmts可以降低DNA再甲基化水平并改善 SCNT 胚胎发育
• 联合 Dnmt 抑制和组蛋白修饰过表达可以提高SCNT 胚胎克隆效率
以上研究结果揭示异常DNA再甲基化是导致克隆胚胎着床后发育异常的关键因素，为研究着床后克隆胚胎的发育提供了新思路。
文献来源：https://doi.org/10.1016/j.stem.2018.07.017
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