工具介绍
Mash扩展了MinHash降维技术，使其成对的突变距离和P值显着性检验，从而可以有效地聚类和搜索大量序列集合。混搭将大序列和序列集还原为较小的代表性草图，进而可以快速估计基因组之前全局突变距离。MASH能用于聚类NCBI RefSeq中所有的基因组，基于组装或者它的reads的实时的基因组聚类，聚类大量的宏基因组数据集。 该工具最终发表在Genome Biology上。
工具下载与基本使用
Github上很贴心，可以直接下载已经编译好的版本：
wget https://github.com/marbl/Mash/releases/download/v2.2/mash-Linux64-v2.2.tar
解压之后就能直接使用了
tar -zxvf mash-Linux64-v2.2.tar
cd mash-Linux64-v2.2/
./mash
我们简单看看其帮助文档：
Mash version 2.2
Type 'mash --license' for license and copyright information.
Usage:
mash <command> [options] [arguments ...]
Commands:
bounds Print a table of Mash error bounds.
dist Estimate the distance of query sequences to references.
info Display information about sketch files.
paste Create a single sketch file from multiple sketch files.
screen Determine whether query sequences are within a larger mixture of
sequences.
sketch Create sketches (reduced representations for fast operations).
triangle Estimate a lower-triangular distance matrix.
Mash 提供两个基本功能用于序列之间的比对 sketch 和 dist。 sketch 功能将序列转化为哈希结构图。 dist 功能比对 序列之前的sketches结果并且返回 Jaccard index的估计值,P值, 还有Mash距离, 这些值能用于估计一个简单进化模型的序列突变率。
具体使用例子
理论说了一大通，现在到大家最关键的环节，这个工具究竟可以怎么用？
例子一：基因组之间的遗传距离对比
下载两个Ecoil的测试数据：
wget https://gembox.cbcb.umd.edu/mash/genome1.fna
wget https://gembox.cbcb.umd.edu/mash/genome2.fna
由于基因组比较小，这里直接调用mash dist的功能：
mash dist genome1.fna genome2.fna
查看结果,不出意料两个基因组遗传距离非常接近：
###Reference-ID, Query-ID, Mash-distance, P-value, and Matching-hashes
genome1.fna genome2.fna 0.0222766 0 456/1000
当然如果我们是要比对差别很大的，两个或者多个很大的基因组，直接使用dist功能就会很慢。这里mash的手册上推荐先使用sketch功能转化基因序列：
mash sketch genome1.fna
mash sketch genome2.fna
mash dist genome1.fna.msh genome2.fna.msh
除了基因组序列外，该功能还能直接应用到序列的reads中（fastq文件）。通过计算不同fastq文件之间的遗传距离，并将遗传距离结果整合可视化，你可以快速的得到你的不同个体测序序列之间的遗传关系：
关于如何具体建树我这里就不细说，但是给大家推荐一个非常实用的Github网站，这个网站已经将Mash构树的过程封装好为mashtree，使用起来非常方便。Github链接：https://github.com/lskatz/mashtree
例子二：构建本地序列的mash数据库进行遗传距离分析
除了上面介绍的例子之外，mash还支持使用已知的序列构建本地的数据库，然后利用该构建的数据库，来对其它序列进行遗传距离的分析。
使用刚刚下载好的genome1.fna和genome2.fna进行本地mash数据库的构建：
mash sketch -o reference genome1.fna genome2.fna
构建好后可以使用info功能对构建好的数据库进行检查：
mash info reference.msh
###输出数据库的信息，证明数据库构成功：
Header:
Hash function (seed): MurmurHash3_x64_128 (42)
K-mer size: 21 (64-bit hashes)
Alphabet: ACGT (canonical)
Target min-hashes per sketch: 1000
Sketches: 2
Sketches:
[Hashes] [Length] [ID] [Comment]
1000 4639675 genome1.fna gi|49175990|ref|NC_000913.2| Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655, complete genome
1000 5498450 genome2.fna gi|47118301|dbj|BA000007.2| Escherichia coli O157:H7 str. Sakai DNA, complete genome
下载新的序列，与构建好的mash数据库进行遗传距离比对：
wget https://gembox.cbcb.umd.edu/mash/genome3.fna
mash dist reference.msh genome3.fna
###结果显示genome3.fna与数据库的比对结果，可以发现genome1和genome3遗传具体是完全一致的（同一个样本）：
genome1.fna genome3.fna 0 0 1000/1000
genome2.fna genome3.fna 0.0222766 0 456/1000
例子三：与已构建好的RefSeq sketch数据库进行遗传距离比对
除了自己构建mash sketch数据库外，我们当然可以下载一些已经构建好的数据库。最常用的要数RefSeq sketch数据库。
下载好RefSeq数据库：
wget https://gembox.cbcb.umd.edu/mash/refseq.genomes.k21s1000.msh
由于mash没有给出测试文件，这里从我自己服务器中大豆的数据中抽取一部分进行测试：
head -n 1600 SRR7817178_1.fq > test_1.fq
head -n 1600 SRR7817178_2.fq > test_2.fq
cat test_1.fq test_2.fq >reads.fastq
这里使用-m 2参数来进一步提高结果的质量，这个参数会忽略掉低质量的单拷贝的k-mer：
mash sketch -m 2 reads.fastq
使用已下载好的RefSeq数据库，对序列的reads进行遗传相关系查询：
mash dist refseq.genomes.k21s1000.msh reads.fastq.msh > distances.tab
查看结果：
GCF_000004515.4_Glycine_max_v2.0_genomic.fna.gz reads.fastq 0.295981 2.36893e-05 1/1000
GCF_000297375.1_ASM29737v1_genomic.fna.gz reads.fastq 0.295981 2.25234e-05 1/1000
GCF_000400935.1_ASM40093v1_genomic.fna.gz reads.fastq 0.295981 2.16808e-05 1/1000
GCF_000400955.1_ASM40095v1_genomic.fna.gz reads.fastq 0.295981 2.16542e-05 1/1000
GCF_000837185.1_ViralProj14097_genomic.fna.gz reads.fastq 0.295981 1.63576e-05 1/1000
GCF_001411555.1_wgs.5d_genomic.fna.gz reads.fastq 0.295981 2.36883e-05 1/1000
GCF_001578535.1_ASM157853v1_genomic.fna.gz reads.fastq 0.295981 1.98188e-05 1/1000
GCF_001662445.1_ASM166244v1_genomic.fna.gz reads.fastq 0.295981 2.31897e-05 1/1000
首先可以看到这些reads是和大豆(G.max)有较近的遗传距离，另外reads里面还含有一些污染，与其它细菌病毒有关系。
这里我们可以发现，mash是可以将reads的污染检测出来。事实上，mash提供了screen功能专门用于污染检测：
mash screen -w -p 4 refseq.genomes.k21s1000.msh|sort -gr |head
检测结果如下：
0.799067 9/1000 1 6.84538e-42 GCF_001343725.1_ViralMultiSegProj188731_genomic.fna.gz [2 seqs] NC_020234.1 Rosellinia necatrix partitivirus 2 RdRp gene for RNA-dependent RNA polymerase, co mplete cds [...]
0.798763 6/672 1 2.34994e-28 GCF_000899295.1_ViralProj176433_genomic.fna.gz NC_018671.1 Sauropus leaf curl disease associated DNA beta, complete genome
0.783786 6/1000 3 2.57053e-27 GCF_001401365.1_ViralProj299179_genomic.fna.gz NC_028095.1 Torulaspora delbrueckii dsRNA Mbarr-1 killer virus strain EX1180 Kbarr-1 killer toxin gene, comple te cds
0.758374 2/666 1 2.73245e-09 GCF_000922435.1_ViralProj259986_genomic.fna.gz NC_024777.1 Small begomovirus-associated satellite isolate Sa19-S1, complete sequence
0.758338 3/1000 1 2.27756e-13 GCF_000911175.1_ViralMultiSegProj225924_genomic.fna.gz [2 seqs] NC_022616.1 Red clover cryptic virus 1 isolate IPP_Nemaro segment 1 RNA-dependent RNA polymer ase gene, complete cds [...]
0.743837 2/1000 27 6.16326e-09 GCF_001590135.1_ViralProj314638_genomic.fna.gz NC_029628.1 Lake Sarah-associated circular virus-21 isolate LSaCV-21-LSMU-2013, complete sequence
0.743837 2/1000 2 6.16326e-09 GCF_000928835.1_ViralProj268860_genomic.fna.gz NC_025790.1 Black sea bass polyomavirus 1 isolate 2835, complete genome
0.743837 2/1000 2 6.16326e-09 GCF_000888115.1_ViralProj45931_genomic.fna.gz NC_013801.1 Croton yellow vein mosaic alphasatellite, complete genome
0.743837 2/1000 2 6.16326e-09 GCF_000848385.1_ViralProj14678_genomic.fna.gz NC_001782.1 Saccharomyces cerevisiae killer virus M1, complete genome
0.743837 2/1000 2 6.16326e-09 GCF_000004515.4_Glycine_max_v2.0_genomic.fna.gz [1191 seqs] NC_016088.2 Glycine max cultivar Williams 82 chromosome 1, Glycine_max_v2.0, whole genome shotgun
可以看到相对上面的结果，screen功能能够输出更加清晰的污染检测结果，包括了identity, shared-hashes, median-multiplicity, p-value, query-ID, query-comment等一系列的信息，更便于污染检测。
小结
mash的使用到这里就结束了，我尽量介绍了mash最常用的功能，更多的具体用法还需要大家回到其工作手册进行查询（原文链接）。总的来说，mash最大的优点就是速度快，使用方便，准确率高，是一款非常实用的小软件。
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