单细胞谱系追踪揭示了TCF15在造血中的作用

发表期刊：Nature

发表日期：2020年7月

发表单位：哈佛大学医学院

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文本目录:

1. 一些之前不知道的基础知识

2. Abstract

3. Introduction

关于LARRY慢病毒barcode文库和inDrop scRNAseq

CRISPR screen

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1.一些之前不知道的基础知识：

1、Lentivirus慢病毒：Lenti-在拉丁文中有慢的意思；慢病毒感染患者早期很难观察，大多都会经历一个长达数年的潜伏期，之后会缓慢发病，因此这些病原微生物被称之为慢病毒。

慢病毒载体：慢病毒载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体，该载体可以将外源基因有效地整合到宿主的染色体上，从而达到外源基因的持久性表达。

2、transduce转导：DNA也可以以病毒或病原菌为载体被带入宿主细胞；应用这种病毒或病菌的转染技术于细胞时，就是对细胞进行transduce

3、heterogeneity细胞异质性：细胞在生长过程中，经过多次分裂增殖，在完成其生命周期的同时也会呈现分子生物学或基因方面的改变，从而产生细胞（状态的或类型的）多样性，这些多样性就叫做heterogeneity。

4、Cluster analysis/Clustering聚类分析：是把相似的对象通过静态分类的方法分成不同的组别或者更多的子集（subset），这样让在同一个子集中的成员对象都有相似的一些属性，常见的包括在坐标系中更加短的空间距离等。

5、Louvain 算法：可探究出细胞异质性的一种聚类分析算法。https://www.jianshu.com/p/ea4140dc72a3

6、DNA barcoding是一种利用基因组内的DNA片段来鉴定生物物种的技术。

动物物种的鉴定采用线粒体细胞色素c氧化酶亚基I基因(cytochrome c oxidase I, COI)作为通用DNA条形码序列。

DNA barcoding

inDropscRNA-seq // Droplet-based single-cell RNA-seq我的另一篇文

7、quiescent cell 静止细胞 在生理情况下，这类细胞增殖不明显，在细胞增至周期中处于静止（G0），但受到组织损伤的刺激时，则进入DNA合成前期（G1），表现出较强的再生能力。

8、LARRY(lineage and RNA recovery) lentiviral barcoding library 我的另一篇文章

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2.Abstract：

论文摘要总览

      骨髓移植疗法依赖于造血干细胞（HSC）的终生再生能力。HSC在克隆水平上呈现出多种多样的再生行为，但这种多样性的潜在机制仍然未定。单细胞测序的最新进展揭示了HSC之间的转录差异，为他们功能异质性提供了可能的解释。但是，测序分析的破坏性造成不能同时观察干细胞状态和功能。

      为了解决这个问题，用可表达的慢病毒条形码（lentiviral barcoding），能够在长期 同时分析 成年HSC的谱系和转录组 和 它们微观重建过程中的克隆轨迹。分析 具有不同行为的克隆 之间的 差异基因表达 发现了 一个内在的分子标志物，该分子标志物能够表征functional long-term repopulating HSCs。通过体内CRISPR筛选探索这一特征，研究人员发现转录因子TCF15是必需的，并且其足以促进HSC静止和长期自我更新。原位Tcf15表达 标记了真正多能HSC的最原始细胞子集。总之，我们的工作阐明了与功能干细胞异质性相关克隆的内在分子机制，并确定HSC保持自我更新状态的机制。

3.Introduction:

      为了同时分析多个干细胞克隆的mRNA和谱系信息，我们从8周小鼠中分离了长期HSC(LT-HSCs)，并用lineage and RNA recovery (LARRY)lentiviral barcoding library对他们进行转导。我们将约1000个标记细胞移植入8周龄致死照射的受体，并且 通过inDrop scRNA-seq 分析 在移植后16-24周迁移细胞稳定状态 的HSC和祖细胞【committed progenitor cell fractions】。我们使用Louvain clustering 来识别不同干细胞和祖细胞类群【progenitor populations】，并 在先前鉴定的标志物的表达基础上 进行标记和合并。然后，我们将 LARRY lentiviral barcodes 分配到每个细胞 去重建克隆关系。重要的是，我们以LARRY对long-term clonal tracking进行基准，证实了：文库多样性足以标记单细胞，barcode calling 对大多数类群【populations】有效，单细胞读数能准确地代表 DNA barcodes，而barcode silencing 可忽略。

      对HSC和progenitor barcodes的评估证实：造血功能主要由HSC维持，如前所述，大多数子代 存在【represent in】 至少一个barcoded HSC。这个实验框架允许我们分析227HSCs的功能性行为，以及他们相关的基因表达程序【programmes】。我们观察到，很大程度上子代输出活动【progeny output activity (Ai)】方面 的克隆异质性，这是由ratio定义的， the abundance丰度of agiven clone i in the committed progenitor pool /its frequency频率 in the HSC compartment range: 0–51, mean = 1.66。引人注目的是，超过55%的 HSC clones (~60% of all HSCs)被归类为 相对low-output，自我更新能力远超过差异化Ai < 1。重要的是，low-output克隆并不是样品的假象，因为高达588个细胞的克隆都显示了这种行为。尽管先前的retroviral逆转录病毒 barcoding 研究表明存在低产量克隆，但我们的单细胞方法让我们能够准确定量并且了解这种特性的程度。我们还发现，HSC clones的谱系偏差【lineage bias（Bi）】有很大程度上的不同，Bi是频率比frequency ratio，anysingle lineage/the other progenitors。特别是，我们发现约30%的克隆呈现出巨核细胞megakaryocyte (Mk) 偏向的输出，并且占所有Mk子代的50-60%，与之前的观察一致。

      除了定义clonal HSC异质性之外，我们的方法还使我们能够同时 表征 功能不同的克隆之间 基因表达的差异。与high-output HSC相比，low-output HSC克隆表现出更高的静态水平【quiescence】和 自我更新标志物，如Txnip, Mllt3, Socs2, Mpl, Mycn, Cdkn1c and Ndn，除了HSCs中描述不足的一些其他成分，包括those encoding fatty-acid oxidation enzymes (Hacd4), MHC class II components (Cd74 and H2-Eb1) and transcription regulators (Nupr1 and Tcf15)。有趣的是，low-output HSC signture和Mk-biased HSC signature有多个相同基因。分析计算的signature scores ，证实了low-output基因和Mk-bias基因 共表达【co-expressed 】 并与高度纯化的天然LT-HSCs的published signatures 重叠，而它们与细胞周期signature score呈负相关，表明HSC移植后相对静止quiescent的状态。HSC output activity (Ai) 和 Mk bias (Bi) 的barcode 测量结果也显示出 显着的负相关（r = − 0.74），证实了low-output 和Mk-biased behaviours 在同一组克隆中 are enriched （P < 0.001）。重要的是，这些行为不限于 通过transcriptional clustering 方法定义的独特的HSC subpopulations，也 强调了克隆追踪【clonal tracking】与研究HSC异质性的相关性。

      总而言之，我们的数据表明，即使在移植后，大量植入的 HSCclones 仍显示出较低的子代output （与clone size无关），对Mk谱系 biasedly，并表达出独特的signature ，其中包含与静止quiescence 和自我更新self-renewal相关的基因。我们认为，移植后，a subset of HSCs 会重新获得与未受干扰的天然LT-HSC相似的构型【configuration】，这对在生命第一年过程中的成熟后代的影响也很小，并表明Mk谱系占主导地位。

关于LARRY慢病毒barcode文库和inDrop scRNAseq

Experimental designfor studying HSC heterogeneity with the LARRY lentiviral barcoding library

 

LARRY慢病毒barcode文库和inDrop scRNAseq

CRISPR screen

利用功能缺失的策略进行的高通量遗传筛选，是研究人员快速寻找调控特定表型的重要或关键基因的主要方法。CRISPR基因筛选，可以通过 CRISPR gRNAs 靶向不同细胞中成百上千各异的基因，然后通过实验筛选编辑细胞，gRNA 可以帮助确定哪些基因对于生物学作用机制具有至关重要的作用。然而，这种筛选方法比较适用于回答与细胞生长能力直接相关的问题。

如果我们想研究基因调控和其它复杂的生物控制机制，就要明白多个基因是如何协同工作还有调控调节细胞状态。这就需要针对每个CRISPR靶向基因，分别进行培养，编辑和分析细胞。

这时候可以采用CRISPR + inDrop scRNA-seq

CRISPR上文讲过，他可以在特定位点敲除基因，进而观察细胞其他结果。

inDrop scDNA-seq，之前的一篇文章有讲解。他可以同时（一次实验），测出几千个细胞的转录组水平。

当这两种技术灵魂大互换之后，诞生除了一种新的技术：CROP-seq（CRISPR droplet sequencing，CRISPR液滴测序）