龙星计划第二天-关于alignment工具

作者: 刘小泽 | 来源:发表于2019-07-30 14:12 被阅读381次

刘小泽写于19.7.30
来北大的龙星计划做助教，接触了一些之前没有了解过的一些知识，简单做下记录，我个人其实是没有这方面需求的
因为课程都是配置在华为云上的，所以使用的数据也都是配置好的，感兴趣的小伙伴其实也不需要自己跑流程(因为用的也都是测试数据)，看看怎么使用参数即可

激活conda

如果看到这里的你有linux基础，那么就可以自己配置conda，自主下载安装软件与环境了

如果发现自己账号下面shared这个目录没有内容(出现No such file or directory 可以联系华为云)

# 教程已经将conda封装好，直接激活使用
. /shared/miniconda3/etc/profile.d/conda.sh
conda activate base

进入测试目录

mkdir -p ~/project/alignment/short-reads
cd ~/project/alignment/short-reads
# 然后软链接数据到当前目录(data、ref、vcf)
ln -s /shared/data/NA12878_test_data/short-reads data
ln -s /shared/data/ref_hg37_chr1/ref ref
ln -s /shared/data/ref_hg37_chr1/vcf vcf

以下全部操作都在~/project/alignment/short-reads目录下进行

质控

看下数据质量

mkdir -p fastqc_output
fastqc -t 2 -o fastqc_output -f fastq data/sr.chr1.2mb_1.fq data/sr.chr1.2mb_2.fq

结果的Html文件用filezilla导出(选择自己合适的版本进行安装=》如何使用请看小洁的解答)

(如果不联网的话，可能图片看不了)

对于结果的解读：

短序列比对

测试 reads are from a 2MB region in chr1

看下数据量

wc -l data/sr.chr1.2mb_1.fq data/sr.chr1.2mb_2.fq
#   2432672 data/sr.chr1.2mb_1.fq
#  2432672 data/sr.chr1.2mb_2.fq
#  4865344 total
# fq文件4行为1个read 因此有1.2 million paired-end reads

方法一 minimap2

这款软件也是BWA的作者李恒开发的，它其实更适合于比对PacBio或Nanopore的DNA/mRNA数据

关于程序怎么用，直接命令行输入minimap2

minimap2 -ax sr ref/hg37d5.chr1.fa data/sr.chr1.2mb_1.fq data/sr.chr1.2mb_2.fq | samtools sort | samtools view -bS - > chr1.2mb.mp2.bam
#  -ax sr 参数含义： "short genomic paired-end reads" 
# 大约1分钟

# 构建索引
samtools index chr1.2mb.mp2.bam

方法二 bwa-mem

bwa mem ref/hg37d5.chr1.fa data/sr.chr1.2mb_1.fq data/sr.chr1.2mb_2.fq | samtools sort | samtools view -bS - > chr1.2mb.bwa.bam
# 大约4min
# 可以加个参数（-t）加速
bwa mem -t 2 ref/hg37d5.chr1.fa data/sr.chr1.2mb_1.fq data/sr.chr1.2mb_2.fq | samtools sort | samtools view -bS - > chr1.2mb.bwa.bam
# 大约2m3.722s
# 索引
samtools index chr1.2mb.bwa.bam

运行命令的同时可以新开一个窗口，登录进去输入top看看运行进程，看到用两个CPU的时候CPU使用量是200%左右

查看bam文件

SAM/BAM文件的格式：https://samtools.github.io/hts-specs/SAMv1.pdf

简单查看

samtools view chr1.2mb.bwa.bam | less -SN # 按q键退出

# 或者直接打印前10行
samtools view chr1.2mb.bwa.bam | head

使用samtools工具

# 格式： samtools tview [options] <aln.bam> [ref.fasta]
# 1.先定义位置，再看
samtools tview -p 1:156000000 chr1.2mb.bwa.bam ref/hg37d5.chr1.fa
# -p chr:pos      go directly to this position

# 2.先看，再定义位置
samtools tview chr1.2mb.bwa.bam ref/hg37d5.chr1.fa
# 然后输入g，就会出现一个对话框，输入1:156000211跳转(如下图)
# 退出这个界面，按q

这里就有人问了？为什么我看到的是类似这种
，而且我的还有其他字符，例如既有,，又有.，又有大写字母，又有小写字母，应该怎么理解，其实简单的搜索就可以解决这个问题：我们只需要搜索samtools tview symbols 类似的字符串，就能找到答案
例如在：https://www.biostars.org/p/151739/就有解释：

找变异

主要利用bcftools这个工具，详见：https://samtools.github.io/bcftools/bcftools.html#mpileup

1 对`minimap2`产出的bam操作

bcftools mpileup -r 1:155000000-157000000 -f ref/hg37d5.chr1.fa chr1.2mb.mp2.bam | bcftools call -mv -Ob -o mp2.bcftools.call.bcf
# 这一步比较慢，大约需要4m25.991s

关于bcftools mpileup

-r: regions
-f: fasta-ref FILE

关于bcftools call

-m: multiallelic-caller
-v: variants-only
-O: output-type b|u|z|v (详见：https://samtools.github.io/bcftools/bcftools.html#common_options)

compressed BCF (b); uncompressed BCF (u); compressed VCF (z); uncompressed VCF (v)
那么b和u有什么区别呢？可以看到上面那个文件是用b参数，下面那个使用u参数得到的，大小差别很大
-o：output FILE

然后查看结果

# 直接看
bcftools view mp2.bcftools.call.bcf | less -SN

# 使用过滤条件(如：只看质量值大于20的变异)
bcftools view -i '%QUAL>=20' mp2.bcftools.call.bcf | less -SN
# -i: include EXPRESSION

像这种低质量的就会被过滤掉

因为bcf文件是二进制，有时需要进行转换成文本文件vcf

bcftools view mp2.bcftools.call.bcf > mp2.bcftools.call.vcf

2 对`bwa mem`产出的bam操作

bcftools mpileup -r 1:155000000-157000000 -f ref/hg37d5.chr1.fa chr1.2mb.bwa.bam | bcftools call -mv -Ob -o bwa.bcftools.call.bcf

bcftools view bwa.bcftools.call.bcf > bwa.bcftools.call.vcf

假如说出现这种报错：

就需要重新运行samtools index chr1.2mb.bwa.bam这个命令

对变异结果检验

bcftools view -i '%QUAL>=200' mp2.bcftools.call.bcf > mp2.bcftools.call.vcf
bgzip -f mp2.bcftools.call.vcf -c > mp2.bcftools.call.vcf.gz
bcftools index -f mp2.bcftools.call.vcf.gz
bcftools stats mp2.bcftools.call.vcf.gz | grep "^SN"
# 结果SN：Summary Numbers
SN  0   number of samples:  1
SN  0   number of records:  2060
SN  0   number of no-ALTs:  0
SN  0   number of SNPs: 1765
SN  0   number of MNPs: 0
SN  0   number of indels:   295
SN  0   number of others:   0
SN  0   number of multiallelic sites:   0
SN  0   number of multiallelic SNP sites:   0
# 发现：1765 snps and 295 indels among 2 millions bp region
# 也就是约2000/2M = 1/1000，和理论上人类基因组中有千分之一的突变相符

另外看看`transitions/transversions`的情况

bcftools stats mp2.bcftools.call.vcf.gz | grep "TSTV"

# TSTV, transitions/transversions:
# TSTV  [2]id   [3]ts   [4]tv   [5]ts/tv        [6]ts (1st ALT) [7]tv (1st ALT) [8]ts/tv (1st ALT)
TSTV    0       1260    505     2.50    1260    505     2.50

其中ts是transitions，也就是转换；tv是transversions也就是颠换

转换：嘌呤和嘌呤之间的替换，或嘧啶和嘧啶之间的替换。
颠换：嘌呤和嘧啶之间的替换。

理论上，全基因组分析中Transition/Transversion比值应该在2左右，全外显子分析中比值在3左右

现在将我们得到的和标准的vcf进行对比

bcftools isec mp2.bcftools.call.vcf.gz vcf/vcf.chr1.2mb.vcf.gz -p minimap2_perf

# bcftools isec [OPTIONS] A.vcf.gz B.vcf.gz […]
# -p: --prefix DIR

# 结果会在minimap2_perf目录中找到四个文件：0000.vcf  0001.vcf  0002.vcf  0003.vcf  README.txt
# 其中：0000.vcf 记录了我们得到的vcf：mp2.bcftools.call.vcf.gz
# 0001.vcf  记录了标准的vcf：vcf/vcf.chr1.2mb.vcf.gz
# 0002.vcf  记录了我们得到的vcf中有多少与标准vcf有交集

# 接下来主要用0002.vcf
bcftools stats minimap2_perf/0002.vcf | grep "^SN"
# 结果如下：
SN      0       number of samples:      1
SN      0       number of records:      1588
SN      0       number of no-ALTs:      0
SN      0       number of SNPs: 1569
SN      0       number of MNPs: 0
SN      0       number of indels:       19
SN      0       number of others:       0
SN      0       number of multiallelic sites:   0
SN      0       number of multiallelic SNP sites:       0

# 可以看到这里的交集中有1588个变异，也就是我们检测的变异中有1588个是标准的，之前总共得到了2060个，那么比例就是1588/2060=0.771。如果只考虑SNP的话，就是1569/1765=0.89

关于bcftools isec生成的4个文件解释：最后两个都是交集为何文件大小差别这么大
https://www.biostars.org/p/224948/ 简单理解就是：因为即使是同一个突变，但在不同的vcf包含的注释信息是不同的

长序列比对

主要使用minimap2

minimap2 --MD -ax map-ont ref/hg37d5.chr1.fa data/np.chr1.2mb.fq  | samtools sort | samtools view -bS - > chr1.2mb.bam
samtools index chr1.2mb.bam
# 关于x的参数说明，有以下几种：
# 1. map-pb/map-ont: PacBio/Nanopore vs reference mapping
# 2. ava-pb/ava-ont: PacBio/Nanopore read overlap
# 3. asm5/asm10/asm20: asm-to-ref mapping, for ~0.1/1/5% sequence divergence
# 4. splice: long-read spliced alignment
# 5. sr: genomic short-read mapping
# 这里的测试数据是nanopore的，所以选择map-ont(ont就是Oxford Nanopore Technologies缩写)

比对完依然是检查bam文件

samtools view chr1.2mb.bam | less
samtools tview -p 1:156000000 chr1.2mb.bam ref/hg37d5.chr1.fa

然后找变异

这里不和短序列一样使用bcftools，而使用了longshot软件，这是一款2019年放出的软件，https://github.com/pjedge/longshot 官方介绍其实很详细了

#先激活一个环境
conda activate longshot

# 它的用法是：longshot [FLAGS] [OPTIONS] --bam <BAM> --ref <FASTA> --out <VCF>

# 然后全部使用默认参数运行
longshot --bam chr1.2mb.bam --ref ref/hg37d5.chr1.fa --out mp2.longshot.o.vcf

同样看看结果

bcftools view -i '%QUAL>=30' mp2.longshot.o.vcf > mp2.longshot.vcf
bgzip -f mp2.longshot.vcf -c > mp2.longshot.vcf.gz
bcftools index -f mp2.longshot.vcf.gz
bcftools stats mp2.longshot.vcf.gz | grep "TSTV"

# TSTV, transitions/transversions:
# TSTV  [2]id   [3]ts   [4]tv   [5]ts/tv        [6]ts (1st ALT) [7]tv (1st ALT) [8]ts/tv (1st ALT)
TSTV    0       1616    529     3.05    1616    529     3.05

看到TS比TV多了3倍

bcftools stats mp2.longshot.vcf.gz | grep "^SN"

# 结果得到了2145个snp，没有indel
SN      0       number of samples:      1
SN      0       number of records:      2145
SN      0       number of no-ALTs:      0
SN      0       number of SNPs: 2145
SN      0       number of MNPs: 0
SN      0       number of indels:       0
SN      0       number of others:       0
SN      0       number of multiallelic sites:   0
SN      0       number of multiallelic SNP sites:       0

与金标准对比

bcftools isec mp2.longshot.vcf.gz vcf/vcf.chr1.2mb.vcf.gz -p longshot_perf
bcftools stats longshot_perf/0002.vcf | grep "^SN"

# 我们得到的结果与金标准的交叉结果
SN      0       number of samples:      1
SN      0       number of records:      1189
SN      0       number of no-ALTs:      0
SN      0       number of SNPs: 1189
SN      0       number of MNPs: 0
SN      0       number of indels:       0
SN      0       number of others:       0
SN      0       number of multiallelic sites:   0
SN      0       number of multiallelic SNP sites:       0

原来短读长比对金标准结果总共得到了1588个变异，这里长读长得到了金标准1189个，计算recall ratio= 1189/1588=0.75；然后我们自己计算得到了2145个，金标准有1189个，计算precision rate = 1189/2145=0.55 ，而这个比例在短读长里面是0.7以上的，因此长读长这个方面略显劣势

那么短读长和长读长之间有多少检测一致呢？

bcftools isec ../short-reads/mp2.bcftools.call.vcf.gz mp2.longshot.vcf.gz -p shortlong_comparison

bcftools stats shortlong_comparison/0002.vcf | grep "^SN"

# 结果看到有1294个交集
SN      0       number of samples:      1
SN      0       number of records:      1294
SN      0       number of no-ALTs:      0
SN      0       number of SNPs: 1294
SN      0       number of MNPs: 0
SN      0       number of indels:       0
SN      0       number of others:       0
SN      0       number of multiallelic sites:   0
SN      0       number of multiallelic SNP sites:       0

因此对于长读长reads进行variant calling操作，还需要更复杂的工具来做，比如谷歌的DeepVariant 、Ruibang Luo开发的Clairvoyante

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同样看看结果

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那么短读长和长读长之间有多少检测一致呢？

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