说在前面
传统意义上，我们认为调节性T细胞（Treg）是以高表达FOXP3、CD25基因，低表达CD127基因为特征的一类CD4+ T细胞。而非Treg细胞（Tconv）在接受抗原刺激激活后，它们也会上调CD25基因的表达，并下调CD127基因的表达，这就增加了在分子层面上区分Treg和效应性Tconv细胞之间的难度。即使我们可以通过蛋白水平（流式细胞术）来很好的区分这两群细胞，但是在分子层面上清晰的区分这两群细胞也很重要。
今天，Immugent就通过解读2022年发表的一篇基于单细胞测序技术的文章，来看一下如何针对此类问题开展研究。该研究综合应用了多个平台的单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，和定量聚合酶链反应（qPCR）技术，并且利用机器学习训练模型，最终达到更好的区分应答和非应答状态下的Tconv和Treg细胞的效果。这个文章的研究思路为我们提供了在应对此类科学问题时，更准确的细胞鉴定方法。
实验设计思路
首先，作者使用细胞分选技术从健康个体的外周血单个核细胞（PBMC）中分离CD4+CD25dim/−CD127+ (Tconv) 和CD4+CD25+CD127lo (Treg)并进行染色，将两种细胞按照最初在PBMC中测量的比例添加到非CD4+ T细胞胞群中。随后加入破伤风类毒素（Tetanus toxoid，TT）或流感（influenza，Flu）进行5天的共培养。接下来，作者使用三种技术：Rhapsody、SMARTseq、Multiplex qPCR by Biomark分别测定CD4+ T细胞群转录组特征，获取不同T细胞亚群的差异表达基因，并基于机器学习的方法筛选区分应答和非应答状态下的Tconv和Treg的标签基因。最后，对于获得的标签基因，作者使用qcPCR和FASC验证上述标签基因区分四类细胞的效能。
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图1：Treg细胞被染色为蓝色、Tconv细胞被染色为红色，基于CD25的表达水平和染色强度将细胞分为应答（response）和非应答（non-response，NR）细胞（应答的T细胞表达高水平的CD25），并使用CD45RO+（记忆性免疫细胞的标志）进一步表征应答和非应答细胞。
区分应答和非应答状态下的Tconv和Treg
随后，作者分别使用Rhapsody、SMART-seq、Biomark三种方法区分四种细胞类型，每种方法都能一定程度上区分细胞类型。
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图2：对TT应答细胞/非应答细胞的Tconv细胞和Treg细胞的基因表达差异
从图中我们可以看出，Rhapsody区分四种细胞类型的效果是最好。FOXP3、IKFZ2和TXK基因可以很好的区分Treg与Tconv，而区分应答和非应答细胞的最佳基因是IL2RA和CTLA4。应答的Tconv可以通过一组几乎唯一表达的基因(CSF2、GZMB、IFNG、ZBED2和IL22)与其他细胞分离；使用SMARTseq可以清楚地区分出应答细胞和非应答细胞；Biomark在四个UMAP集群中观察到的四种细胞类型之间的重叠。因此，作者使用Rhapsody和SMARTseq数据进行后续比较。
区分非应答状态下的Treg和Tconv
为了识别这两种细胞类型的标签基因，作者对Rhapsody和SMARTseq结果分别对非应答状态下的Treg和Tconv进行差异表达基因（DEG）分析，图3c韦恩图展示了两种技术识别的DEGs的交叠情况。图3d和e分别展示了Rhapsody和SMARTseq识别到的部分DEGs结果。
我们已知非应答状态下的Treg和Tconv的FOXP3、IL7R、IL2R、GIMAP5在蛋白质水平上存在差异，因此作者使用Rhapsody和SMARTseq技术测量其在表达水平上是否会展现出相似的差异，但作者发现这四个基因在表达水平上是存在一定程度的交叠的（图3b，左侧Rhapsody、右侧SMARTseq）。
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图3：非应答的Tconv和Treg细胞的基因表达差异
接下来，作者基于两种机器学习算法（支持向量机SVM和逻辑回归LR）的交叉验证的递归特征消除（Recursive Feature Elimination with Cross-Validation，RFECV是一种特征选择方法，通过反复构建模型和评估特征的重要性，逐步减少特征集合的大小，直到达到最佳的预测性能，从而筛选出最具预测性能的特征子集）筛选Rhapsody、SMARTseq和Biomarker的DEGs，共识别出了2种细胞类型间最显著的13个差异表达的基因：FOXP3、IL2RA、IL32、IL2RB、IL7R、TIGIT、IKZF2、CTLA4、GIMAP5、IL12RB2、LGALS1、FAS和TCF7（图4）。基于这13个基因构建的SVM和LR模型被分别用于Rhapsody和SMARTseq技术数据（80%训练集、20%验证集）验证分类器模型效能，结果表明两个分类器无论在测序技术还是不同的抗原刺激（TT、Flu）下都具有较好的效能（表1）。
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图4：机器学习筛选非应答的Treg和Tconv之间标签基因
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表1：各种方法结果对比
区分应答和非应答状态下的Treg
应答的Treg细胞的转录谱与无应答的Treg细胞明显不同，三种测序技术都检测到ICOS基因在应答的Treg中上调、转录因子TBX21、RORC和活化标记HLA II类基因在应答的Treg中上调（这个结论在两种或一种测序结果中被发现）。增殖相关基因HMMR、ZBED2很少在无应答的Treg中检测到，但在大约50%的应答Treg中表达。
对Rhapsody和SMARTseq结果分别对应答和非应答状态下的Treg进行差异表达基因（DEG）分析，图5c韦恩图展示了两种技术识别的DEGs的交叠情况。图5d和e分别展示了Rhapsody和SMARTseq识别到的部分DEGs结果。
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图5：应答和非应答的Treg细胞的基因表达差异
类似的，作者使用机器学习的方法识别了12个（GAPDH、ITGAE、ICOS、IL2RA、TYMS、LGALS1、IRF4、ANXA5、AURKB、BAX、CXCR3和LAP3）标记基因足以区分应答和无应答的Treg。下表展示了基于12个基因的两个分类器模型（SVM、LR）在测序技术或不同的抗原刺激（TT、Flu）下的效能（表2）。
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表2：不同抗原刺激的影响
区分应答状态下的Treg和Tconv
Rhapsody和SMARTseq都可以从这两种细胞类型中区分出大多数细胞。FOXP3在应答treg中的表达显著高于应答Tconv。细胞因子基因IFNG、CSF2、IL22、IL32（两种测序结果支持）IL13和IL21（SMARTseq支持）主要存在于应答的Tconv细胞中。此外，作者使用Biomark也鉴定出了类似的基因。
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图6：应答的Tconv和Treg细胞的基因表达差异
对两种技术共观察到46个DEG使用RFECV筛选出7个标记基因(FOXP3, IKZF2, ITGA4, TRAT1, LGALS1, IL1R2和CD7)用于区分这两种细胞类型。下表展示了基于7个基因的两个分类器模型（SVM、LR）在测序技术或不同的抗原刺激（TT、Flu）下的效能（表3）。
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表3：不同刺激下的效能对比
使用Biomark和FASC验证上述标签基因
利用Biomark技术和FACS对机器学习中识别有应答和无应答的Treg和Tconv细胞的基因进行测试。通过对CD4+CD25+CD127low和CD4+CD25dim/−CD127+细胞的FACS分选分别分离Treg和Tconv细胞，与非CD4+细胞混合后。用葡萄球菌肠毒素B（Staphylococcal Enterotoxin B，SEB）刺激细胞混合物，5天后，通过流式细胞术筛选单个细胞，分离出有应答和无应答的Treg或Tconv群体。其中，在27个特征基因中，有24个成功转移到Biomark的qPCR上。Biomark qPCR检测结果显示：对13个特征基因中的6个(FOXP3、IL2RA、IL7R、IKZF2、GIMAP5和TCF7)可用于区分非应答Treg和非应答Tconv; 6个特征基因中的FOXP3、IKZF2、TRAT1和IL1R2可用于区分应答Treg和应答Tconv的差异; 12个基因的特征基因的8个 (GAPDH, ICOS, IL2RA, LGALS1, IRF4, AURKB, BAX和CXCR3)可用于区分应答和非应答Treg。
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图7：利用多重qPCR (Biomark)和FACS验证特征基因区分细胞类型(图7d：使用补偿荧光强度的FACS分析来可视化来自一个供体的应答性Treg和Tconv细胞的UMAP图，Tconv为红色，Treg为蓝色)。
最后，作者采用基于CD127 (IL7RA)和CD25 (IL2RA)和四个显著标记物FOXP3、IKZF2、ITGA4和TRIM (TRAT1)的FACS策略识别出大部分应答Treg，然后应用于应答Tconv群体。发现这种方式能够识别出72%的应答Treg，而Tconv的0.09%的被识别为应答Treg。
小结
Treg细胞主要作用为调控免疫应答，是维持机体免疫耐受和平衡的一类关键的T细胞亚群，其在自身免疫病、感染性疾病、肿瘤、器官移植等多种疾病中发挥重要的作用。而Tconv主要负责免疫应答的效应阶段，它们参与细胞免疫和体液免疫反应，调节和协调其他免疫细胞的活性和功能，保护机体免受感染和疾病的侵害，并维持免疫平衡和记忆免疫的稳定性。寻找准确的标签基因，从而清楚的区分两类细胞具有非常重大的意义，其不仅有助于我们更好地研究它们在免疫系统中的功能和相互作用，还能方便我们了解背后的免疫调节机制、自身免疫疾病的发生机制以及抗肿瘤免疫应答的调控等。此外，准确的区分Treg和Tconv细胞还对于临床开发免疫治疗策略和个体化医疗具有重要意义。
本研究结合了3种测序技术区分应答和无应答两种状态下的Treg和Tconv的差异性标志物，环环相扣，结果论证十分扎实。三种测序技术的整合规避了测序偏好引起的假阳性结果，同时，作者使用了三种不同的抗原对T细胞群进行刺激，也规避了由单一抗原引起的假阳性结果。最后也对测序技术得到的结果进行了qcPCR验证，使结果更加可靠。小编认为本研究的结果不仅有利于临床上Treg和Tconv细胞的准确分选，也为我们进行单细胞测序细胞亚群的注释提供了思路。
[参考文献]
Reinhardt J, Sharma V, Stavridou A, Lindner A, Reinhardt S, Petzold A, Lesche M, Rost F, Bonifacio E, Eugster A. Distinguishing activated T regulatory cell and T conventional cells by single-cell technologies. Immunology. 2022 May;166(1):121-137. doi: 10.1111/imm.13460. Epub 2022 Mar 2. PMID: 35196398; PMCID: PMC9426617.
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