NGSQC Toolkit 用于进行高通量测序数据的质量检查和数据过滤，具有去接头，去除非ATGC碱基，去除低质量碱基和reads等功能
1 安装
下载NGSQC Toolkit http://www.nipgr.res.in/ngsqctoolkit.html
在linux下解压缩，并给予执行权限
>unzip NGSQCToolkit_v2.3.3.zip
>find/data/home/chjiao/software/NGSQCToolkit_v2.3.3 -name '*.pl' -exec chmod 755 {} \;
2 安装libgd和GD模块
cpan
cpan>installString::Approx
cpan>GD
cpan>GD::Graph #需要安装libgd后才能正确安装
3 NGSQC Toolkit介绍
NGSQC Toolkit包解压后产生4个文件夹，行使以下功能：去接头、去除低质量的碱基、去除模糊的碱基N、格式转换、统计。
QC文件夹含有4个perl程序，能去除454或者illumina reads的adaptor或者低质量的reads。
因为我的数据是illumina测的，所以以IlluQC.pl为例，讲一讲具体使用。
3.1 IlluQC.pl
用于Illumina reads的QC。输入文件为fastq或者fastq的任何变化形式，默认情况下去除掉含有primer/adaptor的reads和低质量的reads，并给出统计结果和6种图形结果。
使用：perl IlluQC.pl <options>
必需参数：
双端：
-pe <Forward reads file> <Reverse readsfile> <Primer/Adaptor library> <FASTQ variant>
<Forward reads file> <Reverse readsfile> 双端测序文件
<Primer/Adaptor library> 接头库的选择
<FASTQ variant>fastq文件格式选择
eg: -pe r1.fq r2.fq 31
单端：
-se <Reads file> <Primer/Adaptor library><FASTQ variant>
单端与双端的参数只在输入文件上有区别，双端输入两个文件，单端输入一个文件
eg：-se r1.fq 3 2
接头库的选择
1 = GenomicDNA/Chip-seq Library
2 = Paired End DNALibrary
3 = DpnII geneexpression Library
4 = NlaIII geneexpression Library
5 = Small RNALibrary
6 = Multiplexing DNALibrary
按照自己测序数据来选择，因为我的数据是RNA双端测序数据，这里的接头库我选择2
FASTQ 格式的选择（不确定的话，用A选项就好，系统会自动的检测fastq的格式）
1 = Sanger(Phred+33, 33 to 73)
2 = Solexa(Phred+64, 59 to 104)
3 = Illumina (1.3+)(Phred+64, 64 to 104)
4 = Illumina (1.5+)(Phred+64, 66 to 104)
5 = Illumina (1.8+)(Phred+33, 33 to 74)
A = Automaticdetection of FASTQ variant
其他参数：
-l设定质量的read长度的百分比的截断值（0-100）默认是70，也就是低质量碱基在reads中比例 >30% 的为低质量reads
-s 过滤碱基质量截断值（整数0-40），默认是20，也就是说碱基质量低于20的即为低质量碱基
-p 线程
-t 输出统计结果的格式，默认是1
1=formatted text
2=tab delimited
-o 输出路径
-z 输出文件的压缩格式，默认是t
t = text FASTQfiles
g = gzipcompressed files
3.2 IlluQC_PRLL.pl
IlluQC_PRLL.pl与IlluQC.pl程序的差别仅仅是多了一个参数
-c 设置cpu，提高运行速度
3.3 AmbiguityFiltering.pl
去除reads中的非ATGC碱基
使用：perl ..\AmbiguityFiltering.pl <options>
必需参数：
-i 输入文件（fastq/fasta格式）
-irev 输入文件（如果是双端测序，这里输入双端测序的第二个文件，可选）
eg：-i f1.fq -irev f2.fq
其他参数：
-c 允许的非ATGC碱基的最大数量默认0
-p 允许的非ATGC碱基的最大比例默认0
-t5 从5'端修剪非ATGC碱基
-t3 从3'端修剪非ATGC碱基
注意：以上4中修建模式4选1
-n 设置丢弃的reads长度，当reads长度低于设定值时会被丢弃默认-1
-o 输出路径
3.4 TrimmingReads.pl
去除低质量的碱基和reads
使用: perl..\TrimmingReads.pl
必需参数：
-i 输入文件（fastq/fasta格式）
-irev 输入文件（如果是双端测序，这里输入双端测序的第二个文件，可选）
eg：-i f1.fq -irev f2.fq
其他参数：
-l 从5'端修剪的碱基数
-r 从3'端修剪的碱基数
-q 从3'端修剪质量分数低于设定阈值的碱基，默认为0
注意：只有当-l或者-r不执行的时候，-q才能设置
-n 设置丢弃的reads长度，当reads长度低于设定值时会被丢弃默认-1
-o 输出路径
3.5 统计工具
NGSToolki提供了AvgQuality.pl N50Stat.pl两个程序来统计数据的平均质量和N50，因为我用NGSToolki处理完会直接用fastqc来查看数据质量，所以这里就不累述这两个程序的功能。
3.6 格式转换工具
NGSToolki提供了
SangerFastqToIlluFastq.pl
SolexaFastqToIlluFastq.pl
FastqTo454.pl
FastqToFasta.pl
4个程序可以将Sanger测序、Illumina测序、454测序、fastq和fasta格式进行转换。
也不累述了，可直接看官方文档。
4 实战：
数据质量问题：
1 测序质量整体偏低，特别是73个碱基后的序列质量，是由于73个碱基后的序列非ATGC碱基的含量很多
2 少量的接头
3 ATGC的含量在reads的后半段依旧是不均衡的
NGSQC Toolkit过滤策略：
1 利用IlluQC_PRLL.pl程序去除接头和质量低于20的碱基以及低质量的reads。
输出结果为：
2个过滤后的fastq文件，和一个html报告文件
报告文件包含一些基本的统计信息，包括接头含量，低质量的reads含量，过滤完接头和低质量的reads之后的reads含量等信息。这里我们可以看出我们高质量的reads的比例是100%，去完街头后的reads数是22093785.
2 用AmbiguityFiltering.pl程序去除reads中的非ATGC碱基N
输出结果：2个过滤后的fastq文件
3 去除低质量的reads
输出结果：2个过滤后的fastq文件
4 用fastq再次检测过滤后的fastq文件的质量
过滤前后数据质量变化如下：
1 Total Sequences
过滤前：22576705
过滤后：3832289
因为我们设置的非ATGC碱基的含量为0，条件比较苛刻，所以过滤掉了大量的reads。
2 测序质量：在reads后半段的平均碱基质量有大幅度的提升
过滤前：
过滤后：
3 Per base sequence content
统计每个位点的ATGC含量，reads后半段的ATGC含量曲线趋近于平行
过滤前：
过滤后：
4 非ATGC碱基含量
清除了所有的非ATGC碱基，非ATGC碱基曲线为百分之0
过滤前：
过滤后：
5 duplicationreads 的比例：
当duplication reads比例>20%时，报warning。过滤后duplicationreads比例低于20%
过滤前：
过滤后：
6 Overrepresented sequences过表达序列：
过滤后无过表达序列
过滤前：
过滤后：
7 接头：接头含量降低
过滤前：
过滤后：
问题：
1根据每个位置的碱基平均质量图，可以看出有些碱基的质量低于20，但在用NGSQC Toolkit的过滤低质量碱基的参数，-q 20（从3'端修剪质量分数低于20的碱基）且默认设置当低质量碱基高于30%时则认为是低质量reads，过滤后结果显示我的高质量reads是100%，未过滤任何低质量的reads。
可能原因：reads中低质量碱基的比例不超过30%，则被判定为高质量reads。
解决办法：后期想利用另一个软件Trimmomatic来试试去除低质量的reads
2 数据GC含量为51%，人类的基因组GC含量在40%左右，后期利用去污染软件kraken，去除其他物种的污染。
吐槽：数据质量太差了，坑好多哇，哭唧唧~另外生信小白痴一枚，要是有大神看不下去给我辅导辅导也是极好的~
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