简介

Bowtie是目前流行的一款DNA、RNA 序列比对软件，开源免费。Bowtie的技术路线基于BWT-FM。BWT-FM 法对内存的消耗很小，被很多工具采用。但是当序列差异度高（mapping 率低）、存在大量gaps 时表现会降低很多,尤其gaps 会显著增加检索空间。一代的Bowtie 不支持gap的比对检测(indel、SV)，Bowtie 2 优化算法后进行了支持（增加了DP算法的阶段）。

Bowtie2算法

分四个步骤：

1. 从reads中截取seeds 以及对应的反向互补序列；
2. 截取的这些seeds使用BWT-FM ungapped方式比对到基因组；
3. 计算每一个潜在比对位置的打分，后续pairwise alignment 优先处理；
4. 利用动态规划算法进行更精确的双序列比对。

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索引

Bowtie 索引技术基于Burrows-Wheller transform(BWT) 以及FM Index。

在FM Index 中检索序列的方法，一般是 Ferragina and Manzini 精确匹配算法。Bowtie 对该算法进行了修改，增加了两个新的步骤。

1. a quality-aware backtracking algorithm （质量感知回溯算法），允许错配并且优选高质量的比对。
2. double indexing， 避免过度回溯的策略。

Burrows-Wheeler indexing

BWT是文本中字符的可逆排列。尽管最初是在数据压缩的背景下开发的，但基于bwt的索引允许在较小的内存占用中高效地搜索大型文本。

对于BWT的技术细节可以参考其他技术文章。

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Searching for inexact alignments

仅可以精确匹配检索，是不足以进行短序列比对的，我们要容忍部分mismatches。

该算法，提出了回溯检查的理念。一般而言由于测序错误导致的mismatch base的质量值会比较低。在比对过程中允许存在有限数量的错配，同时优先选择错配碱基质量值和低的比对路径。

具体流程：先和精确匹配检索类似的工作流程，当遇到没有正确匹配的碱基时，在这个位置引入一个错配使得检索可以紧接着这个位点继续进行。如果出现多个候选的错配位点，算法优先选择位点碱基质量和低的。

回溯算法，应用栈结构，当引入一个新的替换时，栈增长；当比对器丢弃了所有基于该替换的候选比对时，则栈收缩。

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Bowtie1 Excessive backtracking

比对器会花费大量无用工在query序列的3‘ end 进行回溯操作（认为reads 3’ end 的测序错误高）。采用“double indexing”来解决这一问题。对基因组建立两个index：一个是基因组的BWT 称作’forward index’；另一个是基因组的反向序列（非互补）的BWT称作’mirror index’。

原理：如果待比对的read存在一个mismatch，则错配存在序列左边或右边。第一步，载入’forward index’，约束比对器，在序列的右半部分不存在替换；第二步，使用’mirror index’，约束比对器，反向序列的右半部分（原始序列的左半部分）不存在替换。

不幸的是当允许两个或更多的错配时，这种方式无法完全避免excessive backtracking。最后，通过限制整个检索的回溯次数（默认125）来保证检索效率。

Bowtie 2 比对具体流程

Seed extraction

按固定的间隔取read 的连续子序列作为种子（反向互补），相邻种子间可能存在overlap。例如，每隔10bp取20bp的字序列作为种子，就有10bp的overlap；每隔20bp取18bp长的种子，则没有overlap但是存在2bp的gap。

FM Index-assisted seed alignment

采用和Bowtie 1 相同的方式进行（根据参数设定每个种子允许1或0 mismatch）。

Seed alignment prioritization

每个种子通过BWT-FM 匹配到基因组会得到一个行列表，称为“seed-hit range”。seed-hit range 中的每一个row 都对应基因组中可能的一个比对位点。对于人r 范围的range，其中的每一个row 的权重计算为。

SIMD-accelerated dynamic programming

最终双序列比对采用动态规划的算法。动态规划算法可以有效的检测错配、indel，但是其计算量大。常见的算法，Needleman-Wunsch 、Smith-Waterman。Bowtie2 使用swsse2 tool 计算。

Dynamic programming effort limit

有些序列尤其是重复区的序列，会在基因组中找到非常多的匹配位点。对这些位点都进行动态规划的计算是不合理的。设定一个阈值如15 ，当尝试超过15次的动态规划计算都没有获得合适的比对结果就会丢弃。

Reseeding

有些情况下，一个seed map 到上千个位点，这些seed很可能是在重复区。假设，软件设定的seed 是20 bp 间隔 10 bp。 当发现seed 可能在重复区时，seed 会更改为，偏离5‘端5 bp 继续相同的方式构建seed。

参考文献

Langmead B, Trapnell C, Pop M, Salzberg SL. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology10:R25.

Langmead B, Salzberg S. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 2012, 9:357-359.