【现学现卖】CHV1蛋白酶P29抑制RNA沉默

真菌病毒蛋白酶P29抑制天然寄主真菌和异源植物系统中的RNA沉默

之前推送的类似文章【现学现卖】绿色荧光蛋白3-真菌病毒抑制寄主RNA沉默的一个案例

文章概述

真菌C. parasitica中的病毒CHV1编码一个papain-like蛋白酶p29，它和一个RNA沉默抑制蛋白HC-Pro十分相似。（HcPro：是由植物RNA病毒potyvirus编码的多功能蛋白质，可以抑制RNA沉默）

真菌病毒可以编码RNA沉默抑制子也可以作为“RNA沉默是真菌的一种抗病毒机制”的旁证。

试验流程（载体构建）

准备真菌材料，提取RNA和制备真菌原生质体。

准备构建载体，文中具体构建的载体总结如下图（mp29是mutated p29 sequence，在起始密码子后插入两个终止密码子）：

文中特有的载体构建上面介绍完了，文中还有GFP荧光的测量，siRNA的提取和测定，病毒侵染等常规试验，这里就不多描述流程了。

结果

板栗疫霉菌的RNA沉默

为了验证p29可以抑制真菌RNA沉默机制的假说，文中使用一个可以表达荧光蛋白GFP的板栗疫霉菌cpEGFP，转入pGS-2GFP。然后检测荧光，发现转入pGS-2GFP的真菌中，70%的菌株荧光降低了80%的程度。Southern试验发现EGFP启动子和编码序列是完整的，所以荧光表达降低并不是因为序列完整性被干扰。

而后试验选取了荧光降低程度不同的四个真菌菌株，Real-time RT-PCR发现GFP转录本的积累也相应同等程度的降低了。siRNAs的产生被视为RNA沉默发生的标志，对这四株真菌进行GFP-specific siRNAs的检测，结果和预测一样，荧光表达受抑制的菌株中，siRNA积累增多（即RNA沉默发生），说明被抑制的机制是RNA沉默。

蛋白酶p29抑制板栗疫霉菌的RNA沉默

验证p29是否可以抑制RNA沉默，即p29的存在是否可以消除由pGS-2GFP导致的菌株GFP表达量的降低。

首先将“空”载体pCPX-BSD1，以及pCPX-BSD1/p29和pCPX-BSD1/mp29转入cpEGFP菌株，发现只有含有pCPX-BSD1/p29的真菌cpEGFP/p29表现出菌落褪色，说明p29成功表达了。成功转化的菌株cpEGFP/p29/mp29和/BSD1被用于后续实验，即导入pGS-2GFP，试验设计的很严谨，可以在下面的结果图里看出来：

蛋白酶p29抑制植物中的RNA沉默

由于p29的氨基酸序列和植物病毒potyvirus编码的RNA沉默抑制子HC-Pro相近，所以准备试一试p29在抑制植物RNA沉默的能力。利用基于PVX表达载体的病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）的方法。

试验设计和结果如下图（采用的是gfp转基因的烟草）：

探究p29对植物局部和系统性的RNA沉默的影响：长距离有抑制作用

这里用到最后构建的用于农杆菌转化试验的瞬时表达载体，具体的操作和结果如下图，其中烟草仍然是可以gfp转基因烟草，左侧的圆斑为注射位置，右侧的叶片为同一棵植物上的另一个叶片。红色表示发生RNA沉默，绿色为沉默被抑制。

喜欢这个文章试验设计，除了一开始看载体构建时稍微凌乱了，但是我针对载体构建部分画了图，希望可以辅助大家阅读，让试验思路更加明晰。

Segers, G.C., van Wezel, R., Zhang, X., Hong, Y., and Nuss, D.L. (2006) Hypovirus papain-like protease p29 suppresses RNA silencing in the natural fungal host and in a heterologous plant system. Eukaryotic Cell 5: 896-904.