Advanced virus research80期，第2章
真菌病毒，RNA沉默和病毒RNA重组(Nuss, 2011)
与动物植物病毒相比，真菌病毒的复制周期均缺乏细胞外的过程。真菌病毒持久存在于真菌细胞内这个特性是实验设计的一个挑战。然而这个特性，加上真菌寄主的相对简单，同样提供给科学家一个好机会来进行病毒-寄主互作的基础研究，这个角度将与植物，动物病毒不同。
本综述主要以🌰板栗疫病和其弱毒病毒体系为例，汇总了对于真菌抗病毒机制的研究，以及病毒造成真菌弱致病性的研究等。这些发现解释了RNA沉默在真菌抵抗病毒时的作用，以及意想不到的对病毒RNA重组的影响。
1. 简介
与千差万别的真菌不同，多数真菌病毒有类似的生活史和特性。目前多数真菌病毒有ds或者ssRNA基因组。因为缺少胞外生活史，所以真菌病毒的侵染性与传统概念不同。侵染不会通过未感染菌丝暴露在易感染真菌中完成，真菌病毒的传播通过细胞内的机制来完成，比如菌丝融合，有性孢子等。因为真菌病毒的传播不需要释放病毒粒子到胞外，所以有相当多的真菌病毒都不编码衣壳蛋白（Nuss, 2005）。
真菌病毒的生活都依靠真菌，导致其侵染危害不大，多数不会造成严重的症状和细胞死亡。由于病毒和寄主真菌之间关系的约束，导致发展出了新的提供给寄主利益以及潜在使用价值的表型，比如，帮助寄主更加耐热 (Marquez et al., 2007)。甚至，被病毒侵染的植物内生菌还会把这个耐热性传给植物。很多文献报道真菌病毒改变了植物致病菌的致病力，一般会降低真菌的毒力，又称为低毒力菌株。这就为生物防治真菌病害提供了思路（Ghabrial and Suzuki, 2009; Pearson etal., 2009)。
但是真菌病毒只有胞内生活史的这个特性为设计实验研究带来困难。近期研究了造成Cryphonectria parasitica低毒力菌株的病毒与其寄主的抗病毒反应。这些发现将向我们以全新视角展示真菌RNA沉默和抗病毒反应，以及病毒RNA重组。
2. 研究真菌病毒需要克服的技术挑战
板栗🌰疫病病毒的报道引起了人们对真菌病毒的兴趣，并发展了弱毒病毒反向遗传学系统，有三方面，明确病毒CHV-1/EP713的原始序列（Fig. 1, Shapira et al., 1991a）；构建完整cDNA侵染性克隆(Choi and Nuss, 1992)；加强板栗疫病病菌DNA转化(Churchill etal., 1990)。实验室内真菌病毒的侵染从移除真菌细胞壁开始，然后将可侵染性cDNA克隆转化入真菌(Choi and Nuss, 1992)。或者由cDNA克隆转录得到的病毒编码链RNA，通过电击导入真菌原生质体(Fig. 2, Chen et al., 1994)。目前栗疫病病毒的三种毒株都构建了侵染性克隆(Chen and Nuss, 1999; Choi and Nuss, 1992; Linet al., 2007)。
Figure 1. 弱毒病毒CHV-1/EP713的基因组构成。编码RNA链12,712bp（不包括polyA尾巴），包含两个主要的编码区域，ORFA和B。在AB中间有五核苷酸序列，5’-UAAUG-3’，是A的终止子和B的起始子。ORFA编码两个多肽，p29和p40，它们被p29的类木瓜蛋白酶活性自催化，从多肽p69中释放分为两部分。ORFB编码长肽链，包含聚合酶和解旋酶编码区域，以及一个与p29类似功能的p48。
关于栗疫病病菌的基因组和转化能力的研究更加完善了真菌病毒/真菌实验体系。并且已知该真菌中可以复制的病毒来自五个病毒家族Hypoviridae, Reoviridae, Narnaviridae,Partitiviridae, 和Chrysoviridae (Hillman and Suzuki, 2004)。
Figure 2. 左边是转化，右边是转染。两种方法都需要真菌原生质体。对于转化方法，包含全长cDNA的质粒是必须的，再通过DNA介导转化进入真菌(Choi and Nuss, 1992)。转染的方法使用的是T7启动子得到的病毒转录子，通过电击法进入真菌(Chen et al., 1994)。
3. 真菌的抗病毒机制
（A） 营养不亲和性
真菌病毒可以通过菌丝融合的网络传播，菌丝中的隔可以允许病毒或者其基因自由穿梭。然而，病毒在同种真菌不同株系之间的传播一般受基因或者非自我识别系统，即营养不亲和性识别（vic）。营养不亲和的菌丝间互作会造成细胞程序性死亡（PCD），避免了细胞间的交流(Leslie and Zeller, 1996)。
栗疫病病菌的营养不亲和体系被至少六个基因座操控，每个位点有两个等位基因(Cortesi and Milgroom, 1998)。任何位点上等位基因的差异都会造成PCD。不同等位基因对病毒传播的影响程度也不同。病毒传播一般会被快速PCD反应抑制，如果PCD延迟反应有利于病毒传播。有研究表明弱毒病毒hypoviruses有特殊的机制，可以干扰PCD途径（Biella etal. 2002)。越来越多关于真菌基因组的研究可以帮助我们了解不亲和的调节机制。
（B） RNA沉默
营养不亲和在群体水平上抑制了病毒的传播，RNA沉默则在细胞水平上起防御作用。这个RNA干扰反应是植物和无脊椎东西细胞防御病毒的主要机制。主要作用的是保守的核糖核酸酶，Dicer-like和Argonaute-like蛋白质家族(Hammond, 2005)。Dicer核酸酶识别病毒双链和结构化的RNAs，并且利用与RNaseⅢ相关活性将RNAs转化为21-24nts的RNAs片段，称作病毒衍生的小RNAs（vsRNAs）。VsRNAs之后与效应子复合体在argonaute家族蛋白帮助下结合，被称作RNA介导的沉默复合体（RISC）。VsRNA的一条链被降解，另一条指导链引导效应子复合体找到同源的病毒，然后被argonaute相关的RNaseH-like活性切割。对线虫和植物的研究表明，病毒性RNA沉默会被寄主RNA依赖的RNA聚合酶（RdRPs）放大（Ding, 2010）。
模式真菌Neurosporacrassa是第一个用来研究RNA干扰的真菌（Li et al., 2010）。对其基因筛选发现了RNA干扰途径，第一次鉴定了基因RdRP QDE-1 (Cogoni and Macino, 1999)。另外，N. crassa编码两个Dicer-like蛋白， DCL-1，DCL-2和两个argonaute-like蛋白，QDE-2和SMS-2，以及发现的第二个RdRP，SAD-1。这些主要的RNA沉默功能的组成成分参与了两个RNA沉默途径：抑制途径和未配对DNA的减数分裂沉默（MSUD）途径。抑制途径在营养亲和生长阶段作用，首先依靠DCL-2, QDE-2和QDE-1。在dcl-2缺失突变体种，DCL-1可以作为补充。MSUD作用于减数分裂的未配对的基因，依靠DCL-1, SMS-2, and SAD-1。
以上关于基因沉默基因水平的研究都是用模式真菌，该模式真菌没有特别好的真菌病毒。于是Segers et al. (2007)对比N. crassad Dicer基因序列，克隆了C.parasitica的两个Dicer-like基因。研究发现弱毒病毒CHV-1/EP713侵染▲dcl2或▲dcl1+▲dcl2双缺失突变体会严重影响菌丝生长，▲dcl1的对比不是很明显。用另一种病毒侵染的结果与之类似。
VsRNAs的积累是一个寄主依靠RNA沉默方法抵御病毒的明显特征。试验证明结果和之前的突变体实验是一致的。综合结果，证明C. parasitica的RNA沉默只需要一个Dicer基因，DCL-2。
C.parasitica中编码Argonaute-like蛋白的基因是agl1-agl4 (Sun etal., 2009)。预测他们包含保守的PAZ，PIWI结构域。四个基因分别的缺失突变体被病毒侵染后，除了▲agl2，其他与野生型无明显差别。C. parasitica的DCL-2和AGL-2在RNA沉默中起主要作用
与更加高级的真核生物中RNA沉默的作用不同，在植物和动物中，RNA沉默主要用于通过编辑基因编码的茎环RNA前体和其他内源small RNAs产生micro-RNA（miRNAs）来调控发育和代谢途径。但是真菌中好像不是，因为各种突变体在没有病毒侵染的情况下，表型没有差别。一个例外是Mucor circinelloides真菌的dcl2突变体产生有性孢子减少(de Haro et al., 2009)，dcl1则导致营养生长和菌丝形态变化(Nicolas et al., 2007)。然而还发现有些菌完全失去了RNA沉默机制，比如Ustilago maydis（玉米黑粉菌？那很神奇了，可以用来做病毒侵染实验嘛？结果应该也具有参考和对比性。。。好像不太容易感染病毒，还有其他防御机制没有发现。可以研究一下它和prolifereatum）(Nakayashiki and Nguyen, 2008)。
4. 真菌的抗病毒RNA沉默应答的调节
（A） 真菌对抗病毒侵染的RNA沉默途径的诱导和调控
人们（Sunet al., 2009)针对不同突变体菌株在有无病毒侵染形况下上述基因的表达水平实验。AGL2貌似是先起到调控dcl2表达的作用。
（B） 病毒介导的抑制真菌抗病毒RNA沉默反应
感染植物，昆虫，动物的病毒为了抵抗寄主会编码蛋白质，又称作病毒对RNA沉默的抑制剂（VSR），包含了多种抑制RNA沉默的途径（Wu et al., 2010）。栗疫病菌弱毒病毒的p29，它与已知的一个植物病毒的VSRs相似。通过对病毒序列的对比，发现弱毒病毒家族与植物病毒potyvirus家族可能有共同祖先。P29和HC-Pro在结构上都有类锅柄结构的蛋白酶活性，序列上均有催化半胱氨酸和组氨酸残基以及这些基本残基的各自切割位点（Suzuki et al. 2003)。推测p29可以胞间，分子间作用（in trans而不是in cis），加强病毒RNA积累。P29可以抑制栗疫病菌中发卡结构RNA介导的基因沉默，以及抑制烟草Nicotiana benthamiana基于病毒载体和农杆菌转化产生的的RNA沉默（Segers et al. 2006）。
敲除p29基因，病毒RNA积累降低80% (Suzuki and Nuss, 2002)。真菌dcl-2缺失突变体被病毒p29缺失突变体侵染，其结果与两个野生型的侵染结果类似，说明p29直接或间接抵消了DCL2的作用(Segers et al., 2007)。有定量PCR结果表明，p29影响dcl2等相关基因的转录和表达，提供了VSR作用新方式，即抑制转录来抑制RNA沉默反应(Zhang et al., 2008;Sun et al., 2009)。
5. RNA沉默与真菌病毒RNA重组
研究中有一个惊奇的发现，就是真菌RNA沉默对弱毒病毒RNA重组的作用。病毒RNA重组是病毒主要的进化和诞生新病毒的方式。前期对弱毒病毒RNAs的分子鉴定发现了很高水平的缺陷干扰RNAs的积累（DI RNAs）。DI RNAs在亲本病毒基因组的重组缺失情况下产生，如果存在顺式元件就可以通过亲本病毒提供的复制机器进行复制(Roux et al., 1991)。DI RNAs的存在是亲本RNA积累受抑制导致的一种病毒衰弱和持久侵染的现象。也因为这个寄主对病毒的重组干扰，导致想要通过重组让弱毒病毒表达外源基因变得困难(Suzuki et al., 2000)。进而用重组病毒做载体或者治疗手段也很困难。科学家们开始进行研究。
（A） RNA沉默对产生弱毒病毒DI RNAs的贡献
Figure 3. 图中的点是Dicer dcl2作用CHV-1 / EP713病毒产生的vs RNA（18-24 nt）。直线表示病毒基因组位置，线条上方标出了来自RNA正链的衍生RNA，线条下方标出了来自RNA负链的vsRNA（Zhangand Nuss, 2008）。
对于🌰弱毒病毒的vsRNAs克隆和测序发现他们的分布并不是随机的，在7500-11000bp之间存在贫乏，如Fig. 3。Zhang et al. (2008)提议可能是产生的DI RNAs导致生物合成的vsRNA的底物减少，所以这部分vsRNA少。后来对DI RNA测序发现和vsRNA低丰度区域吻合（Fig. 4）。所以DI RNA积累可以说是直接导致了vsRNA在病毒整个基因组上的分布差异（Zhang and Nuss,2008）。
Figure 4. 图Ⅰ是病毒全长，箭头指的是所用的引物。图Ⅱ是病毒衍生的DI RNAs按照全基因组顺序的排列，空缺的部位是缺损的RNA，七个具体的范围也在图Ⅱ上下标识了（Zhangand Nuss, 2008）。
一个没有想到的RNA沉默产生DI RNAs的作用通过病毒转录本侵染野生型真菌和diver突变体真菌的实验被发现了。在被侵染的野生型真菌中，DI RNAs相比于病毒全基因是占有优势的。在dcl2缺失突变体中DI RNAs不会形成，而ssRNA很多，后面又做了突变体和病毒以及真菌的菌丝融合后继代培养的实验并检测，发现Dicer和Argonaute基因，dcl2和agl2由病毒入侵应反应答诱导表达，并在病毒RNA重组和DI RNA产生在起作用。
Zhang and Nuss (2008)推测与传统交换式的RNA重组相比，RNA沉默介导的病毒的重组作用于5’和3’端，使之断裂，避免模板RdRP与之接触。病毒ssRNA的积累在dcl2和agl2突变菌株中积累水平很高。病毒RNA编码链和蛋白的积累是病毒造成缺失突变体真菌衰弱的主要原因（我的菌的dsRNA图片那些条带也可能是DI RNAs，应该不是ssRNA）。
（B） RNA沉默导致弱毒病毒重组载体RNA不稳定
想要弱毒病毒携带非病毒的外源基因到真菌中表达，然而阻碍是可能会被切成DI RNA。人们用绿色荧光蛋白基因做实验，发现果真如此。可以在一些病毒上找办法，比如那些在真菌RNA沉默基因突变体中侵染也不会造成真菌生长衰弱的弱弱弱病毒。
6. 结束语与展望
真菌是个简单易操作的实验材料，目前一些真菌用于研究RNA沉默和RNA干扰途径。对于真菌的研究极大丰富了生物间互作，病毒复制，寄主的应答，表型改变等知识。🌰栗疫病菌和其弱毒病毒实验体系明确说明真菌病毒和动植物病毒一样，利与阐明寄主基因功能，并由操纵寄主表型的作用。
RNA沉默是很多寄主生物的祖传监视系统，抵御外来核酸，包括病毒。虽然沉默大大降低了病毒侵染症状和ssRNA的积累，但是也产生了新的vsRNAs。这个后来产生的RNA片段对真菌基因组以及种族的长期影响还有待研究。当然对RNA沉默途径突变体真菌的实验中，发现真菌除了RNA沉默，也有其他的抵御病毒的途径。
目前p29是唯一真菌病毒编码的反抗寄主RNA沉默的干扰。
真菌和病毒互作的机制是否可以延伸到植物和动物还有待研究。
研究结果可知，我们在使用病毒作为载体或者治疗方法，不得不考虑寄主的RNA沉默途径。反之，如果抑制了病原菌RNA沉默途径，采用相关真菌病毒是很好的生防的方法。另一个有趣的结果是，Biella et al. (2002)观察到了弱毒病毒侵染加剧了vic-associated程序性死亡，这两种防御病毒的途径之间有什么联系呢？
网友评论