III期结肠癌中ctDNA的预后价值及其与辅助治疗持续时间的关系：PRODIGE-GERCOR IDEA-France试验的事后分析
Prognostic Value and Relation with Adjuvant Treatment Duration of ctDNA in Stage III Colon Cancer: a Post Hoc Analysis of the PRODIGE-GERCOR IDEA-France Trial
摘要
目的：循环肿瘤DNA（ctDNA）被认为是切除的III期结肠癌的主要预后因素。我们分析了在IDEA-France III期试验中随机分配的患者的ctDNA。
实验设计：通过微滴数字PCR检测ctDNA的WIF1和NPY，开发并验证了用于结直肠癌的方法。根据治疗持续时间（3/6个月）和疾病分期（高/低风险III期），通过多变量分析对ctDNA样本患者和亚组进行无病生存率（DFS）和总生存率（OS）分析。
结果：在2010例随机患者中，1345例有可用的ctDNA样本（1017例在手术后和化疗前收集）。更多的东方合作肿瘤组表现状态(ECOG PS)为0 (78% vs 69%)， T4和/或N2 (40% vs 36%)在被研究的患者(n=1017)和未被分析的患者(n=993)中观察到。ctDNA阴性877例（86.2%），阳性140例（13.8%）；它们的基线特征相似。在平均随访6.6年的情况下，ctDNA阳性患者的3年无病生存率为66.39%，而ctDNA阴性患者为76.71%（P=0.015）。ctDNA被确认为DFS（校正HR=1.55，95%可信区间1.13–2.12, P=0.006）和OS（HR=0.65，95%置信区间1.12–2.43, P=0.011）的独立预后标志物。ctDNA对治疗3个月的T4和/或N2肿瘤患者具有预后，但对治疗6个月的T1–3/N1肿瘤患者没有预后。
结论：在对大批III期结肠癌患者的首次ctDNA评估中，13.8%的患者术后发现了ctDNA，并被确认为独立的预后标志物。
（IDEA-France 是一项多中心、双臂、开放标签、随机 III 期试验，在 129 个法国中心进行。符合条件的患者年龄在 18 岁或以上；III 期（根据美国联合癌症委员会14a定义的 TNM 分期）)，经组织学证实的结肠癌；并且接受了根治性手术——定义为内窥镜检查显示肿瘤位置大于肛门边缘 12 厘米和/或手术时腹膜反射（高位直肠）以上，没有显微镜下残留疾病的证据——随机前不超过 8 周任务; 东部肿瘤协作组体能状态 (ECOG PS) 为 0 或 1；术后癌胚抗原（CEA）水平≤10 ng/mL（2×正常值）；并在任何特定研究程序发生之前签署了书面知情同意书。）
（数字 PCR 技术是一项突破性的技术，它可以提供超灵敏的、绝对的核酸定量。它对于低丰度目标、复杂背景下的目标、等位基因变异(SNP)以及监测实时 PCR 无法检测到的目标水平的微妙变化特别有用。）
(WIF1: 该基因编码的蛋白质具有抑制 WNT 蛋白的功能，WNT 蛋白是在胚胎发育中发挥作用的细胞外信号分子。该蛋白质包含一个 WNT 抑制因子 (WIF) 结构域和五个表皮生长因子 (EGF) 样结构域，并被认为与中胚层分割有关。该基因作为肿瘤抑制基因发挥作用，并且已被发现在各种癌症中表观遗传沉默。)
(NPY: 该基因编码一种在中枢神经系统中广泛表达的神经肽，并影响许多生理过程，包括皮质兴奋性、压力反应、食物摄入、昼夜节律和心血管功能。神经肽通过 G 蛋白偶联受体发挥作用，以抑制腺苷酸环化酶、激活丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK)、调节细胞内钙水平和激活钾通道。该基因的多态性导致信号肽中的亮氨酸 7 变为脯氨酸，这与胆固醇水平升高、饮酒量增加有关，并且可能是各种代谢和心血管疾病的危险因素。该蛋白质还表现出对细菌和真菌的抗菌活性。)
介绍
在过去的三十年中，III期结肠癌的治疗一直是一个有争议的问题。基于氟嘧啶的6个月化疗是90年代以来的标准辅助治疗(1)，手术切除后氟尿嘧啶单药治疗可降低10%-15%的死亡风险，联合奥沙利铂可降低20%-22%的死亡风险(2,3)。然而，主要由于奥沙利铂的神经感觉毒性持续时间较长，最佳的辅助治疗时间一直受到质疑。因此，进行了六项随机试验的汇总分析，比较了氟嘧啶奥沙利铂（IDEA联合体）3至6个月的疗效。该研究表明，3个月的卡培他滨和奥沙利铂（CAPOX）应用于低风险的III期结肠癌患者（T1–3/N1），6个月的氟尿嘧啶、亚叶酸钙和奥沙利铂（FOLFOX）可能更适合于高危患者（T4和/或N2；参考文献4）。
白血病患者最小残留病（MRD）的概念在近十年前由血液学家提出（5），根据MRD的存在进行治疗现已成为多种血液恶性肿瘤的公认原则。随着分子生物学技术灵敏度的提高，循环肿瘤DNA（ctDNA）可以通过对肿瘤特异性突变进行测序（6，7）或通过甲基化状态评估等肿瘤不可知方法进行检测（8）。因此，使用ctDNA作为CC中MRD的标记似乎很有吸引力（9，10）。原发性肿瘤手术切除后的ctDNA检测与III期结肠癌的疾病复发之间有很强的相关性（7，11，12）。然而，来自回顾性/前瞻性系列的关于ctDNA预后价值的数据仍然有限，大多数情况下，有限数量的患者不一定接受当前标准的辅助化疗。此外，ctDNA在决定治疗类型、强度和持续时间方面的潜在附加价值迄今尚未被探索。
（CC：Colon Cancer）
在本研究中，我们评估了ctDNA在IDEA-France前瞻性III期临床试验(13)中治疗的患者中的独立预后价值，并探讨它是否与III期疾病的辅助治疗时间有关。
材料和方法
研究设计和患者
IDEA-France是一项在法国129个中心进行的多中心、双臂、开放标签、随机III期临床试验(13)。符合条件的患者年龄≥18岁，经组织学证实为结肠癌III期，随机分组前不超过8周有治疗意图的手术，东部合作肿瘤组表现状态(ECOG PS)为0或1，术后癌胚抗原(CEA)水平<10 ng/mL。这项研究是根据赫尔辛基宣言和良好临床实践指南进行的。该方案和转化研究计划获得了一个独立的伦理委员会的批准。
从2009年5月到2014年5月，2010例患者被随机分配(1:1)接受3或6个月的改良(m)FOLFOX6或CAPOX(10)。结果显示，90%的患者接受FOLFOX治疗，6个月的辅助化疗优于3个月的辅助化疗，尤其是高危T4和/或N2亚组。这些结果应该与IDEA国际合作数据一起考虑(4)。
本研究纳入的所有患者均签署了本研究特定转化研究的知情同意书。
评估ctDNA
本文提出的ctDNA分析不是预先计划的，也没有预先设定假设。在IDEA-France研究同意书签署后，最好在开始化疗前收集患者的血浆样本。第一个化疗周期后接受的血浆样本不进行分析。血浆样品制备和DNA分离见补充方法。
ctDNA分析基于多重滴基数字PCR (ddPCR)检测WIF1和NPY基因的高甲基化，使用QX200平台(Bio-Rad)优化之前的分析(补充方法; ref. 14)。采用AmpliSeq Colon and Lung Cancer Panel V2(22个基因)和Base Position Error Rate (BPER)方法检测95例患者的ctDNA，对液滴数字PCR进行正交验证(15)。这组95个样本是随机选择的，但对复发患者样本进行了富集（样本的50%）。对复发情况进行盲法分析。
WNT抑制剂因子-1（WIF1）是一种被归类为肿瘤抑制基因的WNT抑制剂。神经肽Y（NPY）是一种激活MAPK的神经肽。这两个基因都因甲基化而沉默，如果这可能诱导WIF1的WNT激活，NPY甲基化在癌症促进中的作用似乎不太清楚。
WIF1和NPY的高甲基化已被验证为晚期和局限性CC的相关标志物（16，17），例如作为晚期CC患者随访的标志物（8，18），或作为RAS突变检测的补充标记，以确保ctDNA的存在，从而限制此类分析中的假阴性结果（14，19）。该分析允许同时检测WIF1和NPY基因的高甲基化，并使用白蛋白非甲基化序列作为参考，以测量每个样本中的可扩增DNA，并确定甲基化比率测试样本中的标记。尽可能对20 ng提取的DNA进行亚硫酸氢盐转化，如果没有，则将20 mL洗脱的DNA进行亚硫酸氢盐转换。简而言之，亚硫酸氢盐反应是在98℃ 12分钟和64℃ 2小时35分钟。
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统计分析
分别用连续变量和分类变量的均值[标准差(SD)]、中位数[四分位差(IQR)]和频率(百分比)描述基线特征，并使用Wilcoxon检验和X2检验(或Fisher精确检验，如果合适的话)比较有和没有ctDNA分析结果的患者与ctDNA阳性和阴性的患者之间的基线特征。
主要目的是计算手术后和辅助化疗前ctDNA对无病生存期(DFS)的影响，DFS测量自随机分组之日起至记录的第一次放射学复发、第二次CC或死亡(以先发生者为准)。次要目标是计算手术后和辅助化疗前ctDNA存在对总生存期(OS)的影响，OS定义为从随机分组到任何原因死亡日期的时间。探索性目的是分析ctDNA对不同亚组DFS的影响:3个月vs 6个月，T4N2 vs T1-T3N1。失去随访的患者在最后一次随访时被删除。
生存率用Kaplan-Meier法估计，用95%置信区间(CI)描述中位数或3年率，并与log-rank检验进行比较。
使用Cox比例风险模型评估结果和基线特征之间的关联，并提供了95% ci的HR。P < 0.05为差异有统计学意义。
在ctDNA阳性患者中，用限制性cubic splines method研究了ctDNA/ccfDNA比率与预后的相关性，该方法具有图形评估功能，可以确定一个阈值，以确定患者复发或死亡的高风险和低风险。
（ccfDNA：循环游离DNA，circulariting cell-free DNA）
（cubic splines: 由通过一组控制点的分段三阶多项式构成的样条。）
结果
在IDEA-France招募的2010名患者中，1345名患者签署了转译研究的知情同意书，1017名患者符合这项研究的条件(化疗开始前采集的血液样本，结论性ctDNA结果;图1)。
图1 流程图。mITT，改良意向治疗人群; IC,知情同意; TR,转化研究。
总的来说，993例患者因以下原因被排除在本次分析之外: 患者未签署转译研究项目的知情同意书(n=655)、化疗开始后收到的样本(n=274)、技术问题(样本破碎，样本发送，但从未收到，未提取DNA; n=60)，未确定ctDNA (n=4)。纳入的患者(n=1017)与排除的患者(n=993)之间无显著差异; 在被分析的患者中观察到更多的ECOG PS为0(78%对69%)和T4和/或N2肿瘤(40%对36%)(补充表S3)。两组DFS比较差异无统计学意义(P=0.086; 补充图S1)。从手术到术后采血的中位时间为42天(IQR=35-50)。
手术与ctDNA评估不同时间点ctDNA阳性患者的百分比差异无统计学意义(补充表S4)。总的来说，877例患者ctDNA阴性，140例ctDNA阳性(图1)，阳性率为13.8% (95% IC 11.7-16.0)。两组基线特征相似(补充表S4)。在ctDNA阳性组中，38例和101例患者的ctDNA/ccfDNA比值分别为高和低(1例患者不能进行ccfDNA评估)，使用限制性cubic splines methods建议的2%阈值(补充图S2)。此外，在用于交叉验证的95个样本中(87/95检测样本;71: 阴性，16: 阳性)。8份不一致样品中，7份仅甲基化ddPCR阳性，1份为NGS阳性; 8例患者随访时均复发(补充图S3)。此外，甲基化ddPCR的成本和周转时间更低(14)。
(restricted cubic splines method: 是检验关系不是线性的假设或总结过于非线性而无法通过线性关系有用地总结的关系的一种方式。 只是自变量的变换。)
中位随访时间为6.6年（95%可信区间6.5–6.8），ctDNA阳性患者的3年无病生存率为66.4%，ctDNA阴性患者为76.7%（HR=1.46，95%CI 1.08–1.P=0.015；图2A）。
这一比率在2年时为69%对82%，在5年时为65%对73%。cDNA阳性和阴性患者的2年复发率分别为31.4%和17.2%。
图2 根据cDNA状态，Kaplan–Meier估计cDNA阳性和阴性患者的DFS（A）cDNA阳性患者和cDNA阴性患者的OS（B）以及cDNA阴性、低和高cDNA/ccfDNA比率（C）患者的DFS。ccfDNA，循环游离DNA。
OS也有类似的结果；ctDNA阳性和ctDNA阴性患者的5年生存率分别为81%和87%（HR=1.56，95% CI 1.08–2.26；P=0.018；图2B）。在具有可用ctDNA结果的人群中，与具有高ctDNA/ccfDNA比率的患者相比，在ctDNA阴性患者和低ctDNA/ccfDNA比率患者中观察到更好的DFS（HR=0.53，95% CI 0.32–0.88；P=0.015；图2C）。ctDNA阴性并治疗6个月和3个月的患者在DFS方面有更好的结果（图3A）。
预后较差的组包括仅治疗3个月的ctDNA阳性患者。当分别分析具有高风险和低风险III期结肠癌的患者时，这也是正确的，尽管对于那些处于低风险的患者来说没有统计学意义（图3B和C）。补充表S5中提供了单变量分析中多个试验的Bonferroni调整p值。总的来说，ctDNA对治疗3个月的患者（HR=1.51，95%可信区间1.02–2.22, p=0.04）和T4和/或N2（HR=1.79，95%置信区间1.21–2.65，但治疗6个月的患者（HR=1.36，95%可信区间0.84至2.19；P=0.20）和T1-3/N1肿瘤患者（HR=1.17，95%置信区间0.73-1.88, P=0.5117）。
图3 Kaplan–Meier根据ctDNA状态和治疗持续时间（3个月对6个月），对所有患者（A）、高风险III期患者（B）和低风险III期病人（C）的DFS进行估计。
鉴于IDEA-France仅有200名（10%）患者接受了CAPOX治疗，因此未对该亚组患者的ctDNA进行专门分析。然而，我们的结果在观察仅用FOLFOX治疗的患者时仍然相同（补充图S4）。
在单变量分析中，ctDNA状态、临床风险组（低与高）、性别、神经周围和淋巴血管浸润（VELIPI）以及治疗组与DFS显著相关（表1）。
同样，ctDNA、临床风险组（低风险组与高风险组）、年龄、性别、ECOG PS（0与1–2）、肿瘤穿孔、VELIPI和治疗组与OS显著相关。
在多变量分析中，ctDNA仍然是DFS（校正HR=1.55，95%可信区间1.13–2.12，P=0.006）和OS（校正HR=1.65，95%置信区间1.12–2.43, P=0.011）。临床风险组与DFS和OS的独立相关性最强，其次是ctDNA。DFS的其他预后因素包括性别、VELIPI和治疗组，以及OS all，但VELIPI除外。
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