生信小课堂
影响因子：12.4
研究概述：
胃癌的发病率和死亡率分别位居恶性肿瘤的第五和第四（2002年数据），当前主要的治疗是手术结合放化疗，辅以靶向治疗，但总体疗效令人不甚满意。因此需要深入探索影响疗效的关键分子以及进一步开发新疗法。近些年肿瘤免疫微环境（TME）被认为与肿瘤发生发展有密切联系，肿瘤巨噬细胞，肿瘤相关成纤维细胞，PD-1/PD-L1通路，MSI-H状态等对TME的影响相继被报道，但仍没有准确的预测指标来根据肿瘤免疫浸润情况挑选出最有可能从免疫治疗中获益的患者，因此需要分析肿瘤免疫微环境的异质性。组蛋白去乙酰化家族（HDACs）在染色体结构修饰和基因表达两个重要生物学过程中具有重要作用，其中HDAC6，HDAC3等成员以及HDAC抑制剂已被报道能够调节TME以及免疫治疗应答过程中的关键分子与通路，因此单个分子或者单一酶抑制剂难以精准调控TME，需要系统分析HDACs家族的表达谱以及相关的免疫浸润情况从而为胃癌患者疗法选择以及预后评估提供理论基础。在本研究中，作者从HDACs家族的18个成员的bulk转录组出发，联合4个GEO以及TCGA和ACRG胃癌队列进行了多组学的探索，接着进行了两次分型并从中获取差异基因后构建出HCS。随后，基于HCS，作者用自己的配对bulk转录组和单细胞转录组数据进行了降维聚类、细胞通讯两个大模块的分析，发现关键细胞群后进一步对这些细胞簇进行更细分的聚类与细胞通讯分析并得出关键结论。随后，作者进行了药物敏感性分析，分析结果指向GPX4可能是低HCS患者的重要靶点并对此进行了大篇幅的实验验证。总之，这篇文章做到了bulk和单细胞的五五开，做到了生信和实验五五开，工作量之大，值得学习！
本文生信部分本质上是通过分型进行分组，对比不同组的各种差异，然后进行评分，比较分数与肿瘤微环境的关系。需要做类似的生信分析欢迎交流！
研究结果：
TCGA胃癌队列的HDACs多组学景观与基于HDACs表达谱的NMF分型
图A展示了HDACs家族成员的胞内定位。图B是十条肿瘤相关通路的ssGSEA评分与TCGA中HDACs（不同颜色代表不同子家族）表达量的相关性，发现即使是同一子家族的HDACs与通路的相关性方向也不一致。图C是ssGSEA算法评估的不同免疫细胞浸润水平与TCGA中HDACs表达量的相关性，可见如未成熟DC细胞的浸润水平与HDACs表达量普遍负相关。图D展示了基于HDACs表达谱的三个NMF亚型与胃癌患者的生存密切相关。图E是整合了GEO中不同胃癌队列的KEGG富集结果热图，图示的是limma包在亚型间有显著差异的通路。图F是亚型A和亚型C在CIBERSORT算法评估的不同免疫细胞浸润水平的差异，发现两个亚型在重要免疫细胞的浸润水平上有显著差异。
ACRG胃癌队列中再分型并计算HDAC得分（HDS）与分层
图A展示了ACRG队列（作为验证队列）中HDACs在三个亚型间的差异表达情况，显著的PCA分型结果以及KM曲线，初步说明基于HDACs的NMF分型具有较强的泛化能力。图B中Venn图展示了三个亚型两两间的差异表达基因取交集，之后基于交集基因同样进行NMF分型，热图结合临床信息对其可视化，获取HDAC特征A基因集和B基因集，分别是单因素COX回归鉴定的保护基因和危险基因。图C两张柱状图是对基因集A和B的GO富集通路，发现两群基因截然不同。图D的桑基图说明基于HDACs的聚类和基于交集基因的聚类具有很高的一致性，也说明了潜在的生物学机制一致性。图E的KM曲线说明基于差异基因的分型能够准确预测患者生存，图F和G发现两种分型中各亚型的HDS（基于两两亚型差异分析，单因素COX回归，Boruta算法降维，主成分分析计算而来）具有显著的统计学差异。这部分基于自己验证队列的多分型分析说明HDACs家族的表达谱能够定义胃癌患者不同的生物学状态，并基于此计算出了HDS并将患者分为高低HDS组。
关联HDS与临床特征和多组学特征
图A说明TCGA队列中高低HDS分组能够鉴别患者不同生存状态，肿瘤分级以及微卫星不稳定状态。图B和C将ACRG队列的HDS与各种临床信息相关联，在给出队列基线信息的同时说明了HDS具有的强大预测能力，图D分别是基于OS和RFS的单因素和多因素cox回归，发现HDS是稳健的保护因素。图F是不同胃癌队列中HDS与抗原提呈相关基因，共刺激分子以及共抑制分子之间的相关性，发现相关性普遍较强并且分子与HDS的相关性在不同队列中具有很高的一致性。
高HDS可能指向胃癌的“热肿瘤”表型
图A气泡图展示了不同免疫细胞浸润水平与HDS的相关性，发现HDS与免疫杀伤细胞如CD4+, CD8+ T细胞，NKT细胞，Th17细胞呈现一致的正相关，与免疫抑制细胞如M2, MDSC，pDC以及基质细胞等。图B热图说明HDS与血管生成基因普遍负相关，即高HDS患者血管生成不活跃。公共队列的结果表明HDS得分越高抗肿瘤免疫越强，作者进一步用自测的121名胃癌患者队列PKUPH验证这一初步推论，图D先说明HDS能够预测PKUPH队列患者的生存，图E相关性热图一方面说明不同免疫细胞浸润程度之间存在相关性，另一方面与HDS的相关性与在公共队列中的发现基本一致。图F免疫荧光发现高HDS肿瘤样本的CD8与PD-L1表达水平明显高于低HDS肿瘤样本，这与前面的分析结果完全一致。
HDS能够准确预测胃癌患者免疫治疗疗效
图A是使用TIDE算法基于表达矩阵鉴别出responder和non-responder之后，用submap衡量反应分组与HDS分组的异质性，发现有统计学差异，即HDS可预测抗PD1治疗反应。图B是PRJEB40416免疫治疗队列反应分组与HDS及风险分组的关联，但两组之间的HDS得分没有显著的统计学差异。图C是HDS和CPS以及两者联合预测PRJEB40416队列免疫治疗反应的ROC曲线，两者联合预测准确率能够达到0.881，高于单独预测。图D是HDS及其他指标在另一免疫治疗队列PRJEB25780的预测情况，可以发现HDS联合MSI联合CPS能够达到0.96的预测准确性。图E展示了PRJEB25780中各反应表型的HDS评分，结果同样与上述分析一致。图G为预测免疫治疗反应构建了诺莫图，可用于预测免疫治疗反应。
单细胞转录组测序探索高低HDS患者的TME特征
这部分开始转向单细胞转录组的分析，这篇文章亮点之一是使用了自己的bulk转录组和单细胞转录组的配对测序结果，使得深入探索高低HDS组之间的差异成为可能。图A是配对测序的示意图，图B是20个样本的tSNE聚类图，发现了9个细胞群并用热图展示了各细胞群的marker基因。图C展示的是20个配对样本每个患者基于bulk转录组计算的HDS以及风险分组，两个tSNE聚类图分别展示了高HDS组和低HDS组的细胞群分布，图D用柱状图量化了9个细胞簇中高低HDS两组的比例，发现两组患者的TME浸润程度有较大差别。图E是对图D进行的两组检验，发现有统计学差异的正是关键的CD4+T细胞，CD8+T细胞以及NK细胞，这些杀伤细胞在高HDS组中比例更高。图F在表达层面上用免疫荧光验证了高HDS肿瘤组织中CD4以及CD8荧光信号比低HDS肿瘤组织更强。
内皮细胞和纤维母细胞可能通过MIF信号通路抑制T细胞和NK细胞浸润
图A展示两组细胞通讯的交互数量以及交互强度，发现低HDS组有更高的交互强度，图B环形图与热图同样说明低HDS组的细胞间具有更强的交互并且具体到时内皮细胞和成纤维细胞与CD4+T，CD8+T细胞以及NK细胞之间通信强度高。接下来又将这两种细胞在高低HDS组中做了tSNE降维聚类，图C表示鉴定出2个内皮细胞群和6个成纤维细胞群及其marker基因，并基于marker基因对细胞群进行命名。图D与图A基本平行，柱状图展示了每个细胞群中高低HDS来源细胞的比例。因为关注的是能够杀伤肿瘤细胞的CD4+T，CD8+T细胞以及NK细胞，所以对这三类细胞进一步进行了降维聚类，鉴定出22个细胞群后与内皮细胞和成纤维细胞的8个细胞群进行细胞通讯，挑选出与三类细胞通信数量及强度均最高的SFRP2+, MYH11+, CD69+成纤维细胞，CD234+内皮细胞。图F气泡图是对这个亚群和T细胞及NK细胞之间通讯涉及到的通路的探索，发现MIF信号通路在低HDS组中显著富集，作者推断挑选出来的3个成纤维细胞群和一个内皮细胞群可能通过MIF信号与三种效应细胞沟通，从而降低了它们在低HCS样本中的浸润水平。
低HDS组患者中CCL17阳性浆细胞样树突状细胞可能通过MIF信号通路抑制T细胞和NK细胞浸润
除了上一张图B中关注的内皮细胞和成纤维细胞，髓系细胞与T细胞核NK细胞的沟通也较强，于是作者进一步将髓系细胞划分为12个细胞群（图A）并根据标记基因对细胞类型进行注释（图B），图C气泡图展示了每个细胞群的TOP5 marker基因。图D是两组患者各自12群髓系细胞与T细胞以及NK细胞的通讯情况，发现以CCL17+为标记基因之一的pDC细胞在高低HCS组中均与T细胞和NK细胞有较强的通讯。随后，与上一张图F思路一致，图E发现CCL17+pDC细胞与T细胞和NK细胞之间的通讯同样设计MIF通路。图F探究MIF信号通路关键受体在上述细胞及高低HCS组中的表达差异，但结果是阴性的。得到CCL17+pDC细胞群后，作者对这一群细胞进行了KEGG通路富集，发现其功能主要富集在T细胞分化以及抗原提呈等经典抗肿瘤免疫通路中（图G），ACRG队列中CCL17+pDC细胞的富集得分与HDS负相关（图H），但不能对生存分层（图I）。基于以上分析，作者提出：在低HDS肿瘤中，CCL17+pDC可能通过激活MIF通路与T细胞和NK细胞频繁交流从而阻断后者的浸润水平。
在低HDS患者中GPX4可能是肿瘤细胞的重要靶点
图A展示了MIF通路4-IPP抑制剂的用法，图B体外实验说明抑制MIF通路能够减小肿瘤体积，图C说明抑制MIF通路后CD8+和CD4+T细胞数量上升，图D-G流式分析结果表明抑制MIF通路后细胞毒性CD8+T细胞以及CD8+T细胞数量上升。
接下来做了药物敏感性分析，图A是药敏分析的流程图，用的是CTRP2和PRISM的药敏信息以及CCLE的表达信息，主要筛选条件是高低HCS组间AUC有差异以及AUC与HCS的相关性。图B1在CTRP2数据库中发现低HCS胃癌细胞系可能对三种GPX抑制剂敏感，图B2在PRISM数据库中发现低HCS胃癌细胞系可能对两种药物敏感。为进一步探究GPX4抑制剂对低HDS肿瘤患者敏感的机制，作者在CCLE数据库中选取了5个胃癌细胞系（图B3），计算其HDS后发现AGS细胞系的HDS最低，因此选取AGS细胞系用不同siRNA沉默GPX4，选取沉默作用最强的siGPX4-2进行后续实验（图B4）。为进一步探究GPX4抑制剂对高HDS患者的高敏感机制，作者在ACRG和TCGA队列中探索18种HDACs的表达，发现绝大多数HDASs在两组间差异表达（图C），随后作者敲除GPX4验证了公共数据库发现的HDACs差异（图D），敲除后通路富集在代谢和免疫（图E），在沉默GPX4后，作者还发现敲除GPX4后共刺激与共抑制分子的表达发生了变化（图F）。最后，作者在ACRG队列中基于GPX4表达分组发现免疫浸润及细胞因子表达有显著差异（图G）。
GPX4敲除可能促进CD8+T细胞浸润并提升抗PD-L1疗效
这部分用MFC胃癌细胞系探索沉默GPX4后对肿瘤表型的影响。图A的RT-PCR结果以及WB结果表明成功沉默了GPX4表达，且沉默组发生了更多的肿瘤细胞调往（图B）。图C的迁移侵袭实验说明沉默GPX4能够降低胃癌细胞的迁移侵袭能力，，图D的Edu实验发现沉默GPX4能够降低肿瘤细胞增殖率，图E的小鼠皮下异种移植模型说明沉默GPX4能够减少肿瘤体积并与更高的存活率有关。
接下来作者继续探索沉默GPX4对免疫细胞浸润的影响。沉默GPX4后，CD8+细胞水平降低（图A），CD8+T细胞水平上升（图B），CD8+T细胞分泌的IFN-γ增加（图C）。图D示意将小鼠脾脏T细胞与肿瘤细胞共培养，发现与对照组相比，与沉默GPX4的肿瘤细胞系MFC共培养的CD8+T细胞毒性更强（图E）。随后作者进一步探索了沉默GPX4所致CD8+T细胞增强的机制，发现沉默GPX4后PD-L1的mRNA和蛋白水平都显著下降（图F），沉默组小鼠皮下肿瘤移植物的PD-L1 mRNA表达也要高于未沉默组（图G）。最后，作者发现敲除GPX4与抗PD-L1联合治疗可提高胃癌免疫治疗效果（图H）。
研究总结： 这篇文章根据胃癌 HDAC 的表达特征构建了一个 HDS 模型，该模型用于评估TME特征和预测免疫疗法疗效，可以准确反映胃癌的亚型特征，并为胃癌的 TME 提供定量指标。高 HDS 表示肿瘤 "热"，可从免疫疗法中获益。抑制TME中的MIF信号通路和肿瘤细胞中GPX4的表达可能是胃癌冷肿瘤协同免疫疗法的重要策略。
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