最近在看Wiley-Blackwell2010年出版的 G Protein-Coupled Receptors Essential Methods，会不定期分享其中自己比较感兴趣的章节。今天分享的是第一章的第一部分。
第一章 配体与GPCR相互作用的检测
Measurement ofLigand–G Protein-coupled Receptor Interactions
1.1介绍
1.1.1配体-受体相互作用与质量作用定律
放射性配体结合分析利用了物质（配体）放射性衰变的能力进行分析。这种放射性配体与受体之间的相互作用随后可通过捕获和测量放射性物质的量来确定。放射配体结合测定可用于估计分子参数，如组织或细胞中受体的表达量或配体与受体结合的亲和力。
描述配体与其受体结合的最简单方案基于质量作用定律:
配体A与受体R结合形成配体受体复合体AR。配体与受体结合的速率(单位时间内结合事件的数量)取决于配体浓度，未结合的受体数量与结合速率常数Kon。与酶促反应相比，AR不发生降解；如果这个反应是可逆的，那么配体受体复合物可以游离成自由受体和配体，这取决于配体受体复合物的浓度和解离速率常数Koff。虽然结合速率和解离速率可能不同，但随着时间的推移，会出现一种平衡状态，在这种状态下，新的配体受体复合物形成的速度将等于配体受体复合物分解的速度。
在平衡状态下，解离和结合速率常数的比值提供了一个有用的指标，用以衡量配体与受体相互作用的整体强度，即平衡解离常数Ka(尽管有时被称为Kd)，其单位为摩尔每升。Ka也是结合一半受体的配体的浓度。因此，在平衡状态下，配体-受体复合物的浓度由总受体浓度[RT]、配体浓度[A]和配体的平衡解离常数决定:
[RT] = [R] + [AR]
Ka = Koff/Kon.
方程1.1常被称为Hill–Langmuir结合等温线，描述了配体与受体在质量作用定律下的平衡结合，当这种结合对配体摩尔浓度作图时，就会形成双曲线。这个方程最早被A.V. Hill用来描述氧与血红蛋白的结合。如果以配体浓度的对数为横坐标，则浓度-结合曲线呈S形。
如果受体配体结合平衡是一种简单的机制——配体分子的结合不受其他结合事件的影响，并且受体上只有一个配体结合位点——那么，配体浓度与结合的关系会呈现出就以浓度对数为横坐标的一个S形曲线，从10%到的90%结合率会超过100倍，或两个对数单位的浓度范围。这种曲线在线性的陡度，即希尔系数，是相等的。
1.1.2 G蛋白偶联受体的竞争性相互作用
1.1.2.1拮抗剂结合
尽管配体和GPCR的相互作用可以通过直接测定放射性同位素配体的结合来定量，有时利用向体系中添加一系列不同浓度的未标记的配体，测量固定浓度下放射性配体与受体的结合能力的方法更为实用。如果我们考虑配体A在竞争对手B的平衡状态下的结合:
然后，我们可以定义在未标记的竞争性配体B存在的情况下，与同位素标记配体A结合的受体的浓度，这个方程最初由Gaddum推导。
[RT] = [R] + [AR]
Ka = Koff/Kon.
竞争结合数据通常表示为在竞争对手存在时对放射性配体结合的部分抑制。然而，一些配体的结合并不遵循简单的质量作用定律，受体的占用并不总是与配体浓度成正比(见1.1.2.2节)。在这种情况下，希尔系数可能不一致，因此，必须纳入一种配体结合方程，从而得出描述浓度-结合关系的希尔系数，如公式1.3所示:
Y是放射性配体结合，Top是最顶部曲线的渐近线，等于缺乏竞争对手B时总放射性配体的结合，Bottom是底部曲线的渐近线，等于非特异性结合，n是希尔系数，IC50 是抑制放射性配体结合50%时B的浓度。如果希尔系数一致，则可以用Cheng-Prusoff方程确定未标记配体Kb的平衡离解常数：
1.1.2.2刺激剂结合
虽然拮抗剂与受体的结合往往表现出浓度-结合关系，具有一致的希尔系数，激动剂与GPCRs的结合通常更复杂。这在激动剂和放射性标记拮抗剂之间的竞争测定中得到了很好的描述，它们通常表现为较浅的曲线，Hill系数小。这些浅的曲线反映了不同的受体状态，激动剂具有不同的亲和性，(通常)这些曲线的双相性导致竞争曲线的跨度大于拮抗剂的两倍浓度范围(见图1.1)。
图1.1单位点结合模拟的理论竞争结合曲线遵循unity希尔系数(实线)，双结合位点结合遵循浅斜度曲线(虚线)。
还可以采用更为复杂的三元复合模型来解释激动剂与突变受体之间更高的亲和力。但是这个模型带来的好处并不大，因为较简单的三元复合模型就可以充分模拟激动剂与受体的结合。
鸟嘌呤核苷酸,如GDP，GTP，GppNHp和GTPγS的加入经常改变两个结合位点的比例和亲和力，这说明亲和力受体激动剂的分散状态反映了三元复合物的形成：受体激动剂，GPCR和鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)。一个三元复合模型(TCM)被提出来解释激动剂与放射性标记拮抗剂的竞争结合试验中观察到的浅曲线，但是需要一些通常不满足的假设。例如，必须假设G蛋白是有限的，因此不是所有的受体都能与G蛋白形成复合物，从而使G蛋白偶联(高亲和力)和非偶联(低亲和力)受体都能被观察到。这在用于研究许多配体-GPCR相互作用的细胞系统中很少观察到，其中G蛋白水平往往超过受体表达水平。
1.1.3变构配体
对于许多GPCRs，有一些配体会结合在一个与内源性或原位配体结合截然不同的拓扑结构位点。
这些结合位点和与其结合的配体被称为“变构”。由于变构配体不直接与正构配体竞争结合，它们有能力形成三元复合体(见图1.2)。
图1.2正构配体A，变构调节配体B与受体R结合的三元复合模型。
Ka和Kb分别是A和B与R的平衡解离常数，α是A和B之间的绑定协同参数(A对R和RB的选择性或B对R和AR的选择性)，因此，它决定了B对A结合的影响，反之亦然。
变构配体与受体的结合可能改变受体的构象从而改变了正构配体的结合，反之亦然。这些变化在结合中被称为“协同效应”。
在结合方面，变构三元化合物模型预测变构调节配体可能抑制(0 <α< 1)，增强(α> 1)或不影响(α= 1)的正构配体的结合。最近一些综述对受体、正构配体和变构调节配体之间三元复合物的形成进行了描述，增加了我们对此类化合物物的理解，提供了可用于检测和分析变构相互作用方法的详细信息。
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