今天分享一篇利用单细胞核转录组来研究玉米气孔开合的文章，河大宋校长发的，做的挺好挺全面的。
表皮作为叶上最外层细胞，作为第一道屏障，起着植物和外界互作的重要作用，并参与各种各样的生物和非生物胁迫。作为表皮中重要的气孔细胞，它决定植物光合作用和水分利用效率，来迅速响应变化的环境条件。
在这篇文章中作者的样品总共有两部分：
1）单细胞核转录组的样品：3个玉米的叶表皮，1个玉米叶原基。
2）RNA-seq：WT和ZmMUTE突变体中收集富含表皮原细胞（PDCs）、保卫母细胞（GMC）和幼嫩保卫细胞与副卫细胞（YGCs-YSCs）的三个气孔发育阶段的细胞进行转录组测序。
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叶片表皮细胞图谱
对于叶片表皮的单细胞核转录组分析发现，聚类显示细胞可以分为6个不同的类型（下图）：叶肉细胞（MCs），维管束鞘细胞（BSCs），具有花青素合成的扁平细胞（PCs-A），缺乏花青素合成的扁平细胞（PCs-N），气孔保细胞（GCs），气孔副卫细胞（SCs）。
2. 保卫细胞中调控气孔的相关基因
许多文献中已经报道了GC中的淀粉降解、叶绿体活性和转运蛋白在调节气孔开闭上具有重要的功能。但是GC中的基因是如何调控气孔的开闭的还并未完全解决。因此，从获得玉米的表皮细胞图谱将有助于解析气孔调控的关键作用模型。
首先，叶绿体是GC参与渗透调节（osmotic regulation）的特征之一。作者发现光收集复合物I和II（LHCI和LHCII）、光合作用I和II的反应中心（PSI和PSII）以及C4途径的初始羧化阶段的相关基因都在GCs中低表达，而参与线性电子传递的铁氧还蛋白NADP+氧化还原酶 (FNR) 低表达，而依赖于NAD(P)H脱氢酶 (NDH) 循环电子传递的一种组分，亚复合物b4的光合NDH亚基 (PnsB4) 在GC中高表达，这些结果表明在GCs中光分应主要产生ATP（下图A）。
其次，作者查看了淀粉代谢合成相关基因的表达，因为有研究表明淀粉-糖的转化使得细胞渗透压改变从而调控气孔的开闭。作者发现GCs中编码淀粉代谢相关蛋白的基因高表达，并且在BSCs中也观察到了不同的淀粉代谢基因的高表达，这说明淀粉的理化性质可能在BSCs和GCs之间存在差异。
最后，因为有研究表明渗透调节信号控制气孔开闭主要是通过转运蛋白来调控的。所以作者查看了转运蛋白和通道相关基因在GC和SC中的表达规律。然后发现编码钾离子、钙离子、氯离子、铁离子、苹果酸的相关转运蛋白均在GCs中特异高表达。但也有一些其他转运蛋白在SCs中高表达，这与先前研究结果一致，有部分转运蛋白在GCs和SCs中都表达，如硫酸盐转运蛋白（下图B）。
3. GCs和SCs之间链接的信号通路
虽然我们知道GCs可以感知多种环境因子，比如光照，二氧化碳，植物激素等，但是这些信号通路是如何参与气孔开闭的调控的确未知。
ABA可以通过激酶/磷酸酶介导，次级代谢产物和GCs中的离子通道调节气孔的开闭。所以作者查看了ABA通路上的关键调控基因，包括OST1，MYB60/96，ZmSLAC1，SLAH3等，发现都是在GCs中特异表达的（上图B，下图C）。相反的，SnRK2以及ABA的抑制的基因AKS1/3则是在SC中特异表达。在拟南芥中报道可以增加ABA level的NRT1.2，发现在SC中富集，但是在GC中只少量富集。相反的，SnRK2以及ABA的抑制的基因AKS1/3则是在SC中特异表达。
ZmNRT1.2在拟南芥中的同源基因，在Xenopus laevis oocytes中表达后ABA含量显著增加，并且氮转运速率增加（下图A，B）。ZmNRT1.2发现在SC中富集，但是在GC中只少量富集（下图C）。
作者接下来查看了其它激素的情况。PIN1，ZIFL1和生长素转运相关的2个基因在GC中特异表达（上上图B）。而SAUR32，一个生长素响应的基因则在SC中富集。AtCO2，一个参与乙烯合成的关键基因在SC中富集。但是ACC基因则在GC和SC中均有表达。
然后作者查看了和光照有关的marker基因的表达规律。ZmPHOT1，一个蓝光影响气孔开闭的关键基因在SC中富集。但是其它蓝光调控关键基因，例如CBC1/2, BLUS1, HY5, CHX20，则在GC中富集 （上上图C）。
因为钙离子是气孔信号通路的第二信号因子，所以作者查看了钙离子运输方面的功能基因。OSCA1， CNGC15， SCS等在GC中特异表达。
4. ABA和CO2在GC和SC之间调控气孔的响应
这一部分和3的结果，我总觉得作者讲逻辑稍微有点乱，感觉两个部分可以合起来。
上面作者探索了各种已知的信号通路基因在GCs和SCs中表达的异同。这部分可能是重点强调ABA和CO2如何影响气孔的开闭的。除了3中的marker基因，作者又重点研究了GCs和SCs的其它特异表达基因。例如，ZmCYP707A4的表达与SCs特异，主要参加GCs降解ABA的过程（上图C），并且发现ABCG22基因可能负责ABA转运，在GCs和SCs中也显示出高表达，这说明ABA代谢在GCs和SCs之间协调气孔开闭的快速动态响应。同时作者通过定量共聚焦显微镜测量GCs和SCs的体积，从而计算细胞内ABA浓度，也证明了GCs和SCs不同的ABA稳态特征可能与气孔关闭的协调有关（上图D，下图E）。
CO2信号是由GCs直接感知还是由其他细胞类型（MCs或SCs）感知，以及这些信号如何汇聚到气孔开闭信号通路也是争议的问题。作者查看了CO2传感器β-CA1的玉米同源基因（Zmβ-CA1），发现在SCs和MCs中表达均升高。同时作者通过敲除实验也证明了Zmβ-CA1可以将CO2转化为HCO3-，并且SCs具有参与CO2-HCO3-聚集和CO2传感的潜力（上图F-H）。
5. 玉米叶基气孔发育轨迹构建
为了深入了解GCs和SCs发育的分子基础，作者使用叶基样本进行snRNA-seq，分析得到了14个亚群，使用已经发表的玉米组织单细胞转录组数据对叶基数据进行注释，主要细胞类型有气孔、叶原基、表皮细胞、维管束细胞等（下图A）。使用比较重要的气孔marker基因，例如：GC特异表达的FAMA和SC特异表达的CST1等都确认cluster 11是气孔细胞（下图B）。
为了研究调控气孔发育的网络，作者对气孔细胞（亚群11，共含有116个细胞核）进行拟时分析发现GMC的早期发育阶段到幼嫩GCs阶段，SMCs的早期阶段到幼嫩SCs阶段（上图C）。接着作者查看了气孔发育相关基因的表达以及定位情况。例如CST在YSCs中表达量较高（上图D）；ZmGELP1在YGC-Gs中特异表达，ZmGELP2则在幼嫩和成熟气孔中特异表达（上图E-F）；ZmMPK12在幼嫩和成熟的气孔中都可以观察到（上图G）；ZmMUM2在在GMCs中特异表达（上图H）。作者接着查看了其它气孔发育相关的marker基因在气孔分化不同时期的表达和定位情况（上图I）。
6. 细胞壁形成相关基因对气孔开闭状态的调控作用
在气孔发育过程中，细胞壁经历了多种动态变化，包括两个YGCs间细胞壁的降解形成气孔、气孔成熟时GC壁的增厚以及伴随气孔运动的动态变化。其中最有趣的一个问题是在气孔的功能寿命中，壁多糖、脂质和蛋白质是如何在GCs中协调合成、沉积、重组、修饰和降解的。
通过查看细胞特异表达基因，作者发现了大量与细胞壁代谢相关的同源基因，尤其是果胶代谢的两个基因，在GMC和SMC阶段表达；与纤维素和木质素改性和降解相关的基因（ZmMUM2等）在4种细胞类型中均有表达；与角质层代谢相关的脂质转运在SMCs和GMCs中优先表达（下图A）。但是对于这些基因是如何影响细胞壁的形成，以及如何调控气孔的状态确是未知的。
6. ZmMUTE控制早期GMC时期的不对称分裂以及气孔的细胞壁形成
前面作者在轨迹分析中验证过MUTE在气孔不同发育阶段的表达规律，这里为了进一步研究MUTE在玉米气孔发育中的作用，作者从WT和ZmMUTE突变体（缺乏正常的气孔复合体）的三个早期气孔发育阶段（分别富含PDCs、GMCs和YGCs-YSCs）的样本获取bulk RNA-seq数据（其实最后为什么落脚到了这个基因，我也不清楚，可能实验室一直在做这个基因，刚好形成了完整的故事链）。将叶基单细胞数据的上调DEGs与bulk RNA-seq数据的三个发育阶段的DEGs取交集得到了28个基因，这些基因都是之前气孔细胞鉴定的标记基因。基于bulk RNA-seq数据中28个基因的表达量进行聚类，鉴定出18个基因在WT的GMCs和YGCs YSCs中转录水平升高，但在突变体相应阶段大幅下调。ZmMUTE直接或间接影响的其他重要调控成分也被鉴定出来，包括编码ZmSCS1的基因、包含ICP4结构域的蛋白、两个包含NAC结构域的蛋白、一个蛋白磷酸酶2C家族蛋白和一个蛋白激酶。这些结果都为MUTE在气孔发育过程中的作用提供了证据。
最后，作者根据在单细胞数据中发现的结果，以及marker基因总结了一张调控气孔发育和动态的调控网络。
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