14.捕获测序

现在常用的目标区域捕获测序技术主要分为三类: hybridcapture（杂交捕获）,molecular inversion probes（分子倒置探针，MIP）和 多重PCR。通常适用于检测几十到几千个位点，或几十kb以下的区域。

杂交捕获

杂交捕获的原理是通过人为设计探针与目标区段部分或者全部互补将目标区段捕获，未设计探针区段的片段则会被洗脱丢弃，之后通过变性将探针和被捕获的片段分开进行二代测序文库构建。
根据探针的状态不同，杂交捕获又分为固态杂交和液态杂交。固态杂交就是在芯片上布满了探针，通过探针将目标区段捕获。液态杂交是将探针放在液相中，探针携带生物素，当杂交完成后，通过磁珠可以将探针吸附（此时探针有携带目标区段的和空探针），随后将未被捕获的片段丢弃，再通过变性将探针和目标片段分开，然后利用磁珠将所有空探针吸附丢弃，捕获完成。
杂交捕获最大的优点是捕获区段大，可以达到几百MB；同时根据探针的原理其均一性很好（均一性是评价捕获技术很关键的参数，均一性好后续测序成本就会下降）。杂交捕获的缺点是特异性较差，容易捕获非目标区段，因为杂交前样本会被随机打断（一般认为500bp是比较合适的长度），探针捕获时可能和目的片段部分杂交，导致一些含有部分目标区段的片段被捕获，导致特异性下降。

MIP

MIP技术本质上是以连接-PCR反应捕获的技术，其原理是设计一个口袋状探针，探针分为三部分：为后续构建文库所用的通用序列，以及探针的5‘端和3’端。探针的5‘端和3’端与目标区段退火结合后，利用DNA聚合酶将探针缺口补齐，通过DNA连接酶将缺口处磷酸二酯键连接，即可构成一个完整的环状探针。再利用外切酶将剩余未捕获探针和DNA序列消化，将不受外切酶影响的完整环状产物保留下来，随后利用蓝色通用序列作为后续文库构建的引物，添加index和测序引物，扩增后作为二代测序文库。 MIP捕获.png

MIP的优势是特异性好而且捕获完成后的片段能够直接进行建库，其缺点则是捕获效率不高，有些区段难以设计探针进行捕获。

多重PCR

多重PCR靶向捕获测序技术则是利用多重PCR反应，同时扩增多个目标区域序列，得到扩增子产物；然后通过PCR反应或者酶连接反应，将二代测序所需的接头序列（adapter）引入到扩增子产物的两侧，得到扩增子文库；最后进行二代测序。
由于引物的设计还是体系的价格都是最简单的，而且设计门槛低，不需要特殊的实验设计，因此PCR-目标区段捕获也是商业化应用最广泛的方式。

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