微生物组项目设计(一)

        基于高通量测序技术，在核酸水平进行微生物组研究是目前人体健康，医学诊疗，环境科学等方面研究的热点。常用的技术方法主要包括基于扩增子测序的多样性研究、宏基因组测序及宏转录组测序。

很多老师在即将开展微生物组的项目初始，都会面临这样或那样问题，诸如：

1、什么样的技术方法适合于我的研究？

2、如何才能低成本高效的实现我的研究目的？怎么样的实验设计能确保顺利开展后续的分析？

3、如何才能让我的实验设计标新立异，发一个高分paper?

        从这一期开始，线条姐会结合凌恩的微生物项目经验，跟大家分享下“微生物组项目设计”的那些事儿，今天这一期，先跟大家聊一聊微生物组项目技术方法的选择。

       如上图所示，微生物组的研究分为DNA层面和RNA层面。在DNA水平上又分为多样性测序和宏基因组测序。那么，这些项目该如何进行选择呢？这就要从不同技术方法的原理和适用性上来讲一讲了。

       首先，目前市场上价格最低的，也是文献报道最多的方法，就是多样性测序了。它的原理是基于微生物基因组的特征性序列（如细菌的16s rDNA，真菌的ITS等）进行测序和分类。简言之，就是以小见大（类似于通过指纹进行身份识别）。它的测序范围只是通过扩增检测微生物基因组上的一小部分，研究目的也只倾向于物种的分类识别和相对丰度统计。多样性项目有一个特点，靶向性明确。根据引物来确定需要研究的微生物类群，一对引物只针对样本中的细菌，或真菌，或某一类微生物群落。

       与之不同的是宏基因组和宏转录组，由于不需要通过PCR进行特征性序列的筛选，这两种技术的研究范围是样本中的全部微生物信息。也就是说，基于宏基因组和宏转录组研究得到的结果，是不单独区分细菌或者真菌的。此外，由于测序分析的范围不仅限于特征序列，这就有助于我们获取真实的基因组信息，开展功能研究。

那么，宏基因组和宏转录组研究的差别又在哪里呢？我们可以看一下下边这张统计图：

蓝色线标记的是DNA相对丰度分布，红色线标记的是对应RNA的相对丰度分布

       从这里我们可以看出，同一个基因（或功能模块），很可能在少量DNA存在的情况下，会有RNA的高表达（提示该基因活跃）；也存在高丰度的DNA,在RNA水平上实际表达量很低的情况（提示该基因不活跃）。此外，我们还知道，相较于DNA的高度稳定性，RNA是极容易降解的。所以在自然环境下，一些死去的微生物会有DNA残留，而RNA是会很快降解的。这就是宏转录组研究的意义所在——探究环境样本中真正具有活性的微生物和具有活性的基因及功能。

       由此，我们可以看出，不同的技术方法有不同的研究侧重。扩增子测序可以实现精确的定性和较好的相对定量研究，对于只要求了解微生物群落构成及不同实验组之间微生物群落差异的老师而言，低成本快速高效的多样性研究是不二之选。宏基因组和宏转录组测序则更偏向于功能研究，前者注重的是潜在功能的分布，后者更侧重于活性物种的活性基因和活性功能。对于关注微生物组功能的老师而言，较高的成本可以得到更为理想的数据用于此类研究。还有的老师表示，如果我想进行更广泛和深入的研究，可能会用到多种技术手段，那么也可以进行这几类技术方法的合并使用和关联分析，这部分内容我们会在后续的分享中一一为大家开展介绍。

我们下期见！