1. 来源
影响因子：5.574 PMID：29391233
期刊年卷：Pharmacol Res 2018 04，
DOI：10.1016 / j.phrs.2018.01.011
2. 摘要：
以黄芪、大黄连、黄连、葛根为主要成分，设计中药复方芪健合剂，通过代谢组学、肠道微生物区系、系统药理学等方法对其安全性和有效性进行研究，以期达到改善2型糖尿病(T2D)的目的。
结果表明，芪健合剂具有较好的抗T2D作用，是一种治疗2型糖尿病的中药新方，其主要成分为黄芪、大黄连、黄连、葛根，用于改善2型糖尿病(T2D)。
采用雄性KKay小鼠(2830g，89周，空腹血糖≥为7.8mmoL/L的KKAY小鼠被认为是糖尿病）和C57/BL6小鼠(1819g，89周)，研究芪健合剂的降血糖作用。将30只KKay糖尿病小鼠随机分为5组，即模型组(Model)、低芪健合剂组(QJM(L))、高芪健合剂组(QJM(H))、葛根芩连汤中药(GGQL)阳性组(GGQL)、西药(盐酸二甲双胍)阳性组(二甲双胍)。C57/BL6是健康对照组(Control)。
并采用系统药理学方法对芪健合剂作用所涉及的生理指标进行了评价。芪健合剂急性毒性试验和HE结果均未见不良反应，与模型组相比，芪健合剂能安全有效地调节血糖水平。
芪健合剂的降糖效果不如盐酸二甲双胍，但两者的降糖趋势相似。
基于~1H-NMR代谢组学研究，对芪健合剂治疗组的代谢产物进行了鉴定。研究了齐建混合物相关的55个蛋白质和4条信号转导途径，包括半乳糖代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解代谢、氨基酰tRNA生物合成代谢和丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径。
肠道微生物区系的PCoA分析表明，芪健合剂处理后的肠道菌群显著富集。
此外，系统药理学结果显示芪健合剂通过TP53、AKT1和PPARA蛋白发挥作用。
结论：芪健合剂能有效减轻T2D，其作用机制可能与其代谢物特征和肠道微生物区系的改变有关。
备注：芪健合剂来源：作者通过现有糖尿病的中药处方分析总结发现。
分组：
（1）低芪健合剂组(QJM(L))剂量为1.795g/kg/d，
（2）高芪健合剂组(QJM(H))剂量为5.385 g/kg/d。
（3）葛根芩连汤能改善T2D，因此被选为中药阳性药。作者使用葛根芩连汤片由吉林肆意制药集团(吉林省梅河口市)提供，根据动物与人的体表面积当量换算，本研究选用小鼠每日剂量为0.942 g/kg/d。
（4）二甲双胍(中国上海世贵宝药业公司)按西药阳性剂量0.314 g/kg/d给药。
（5）C57/BL6(对照组)给予生理盐水10ml/kg/d，共给药8周。
（6）模型组(模型组)给予生理盐水10ml/kg/d，共给药8周。
3. 结果：
3.1 芪健合剂颗粒由北京同仁堂药业(中国北京)提供
原料与颗粒剂的换算为：黄芪(700：100)、卫矛(1667：100)、葛根(1250：100)、黄连(1100：100)。
3.2 UPLC结果
芪健合剂中含有的化合物种类繁多，主要分为6大类：黄酮类(芒柄花素；萼花苷；小檗碱；小檗碱；葛根素；3‘-羟基葛根素；4’-甲氧基葛根素；大豆皂苷BB；鼠李糖苷-3-o-β-D葡萄糖苷)；生物碱(8-oxocoptisine)；糖苷苷元(杆菌酸)。
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3.3 急性毒性研究
急性毒性研究芪健合剂组小鼠给药当天活动较少，粪便呈褐色、柔软、水样，次日排便功能恢复正常，安全性较高。
3.4 生化分析
6组8周体重、空腹血糖(FBG)、糖耐量试验(OGTT)、总胆固醇(TC)和胰岛素(INS)的详细数据见补充在线表2。在8周体重方面，QJM(L)组、QJM(H)组、GGQL组、二甲双胍组和Model组之间差异无统计学意义(P>0.05)，说明初始体重对FBG无任何影响(图1B)，说明QJM(L)组、QJM(H)组、GGQL组、二甲双胍组和Model组之间差异无统计学意义(P>0.05)。QJM(H)、GGQL、二甲双胍组空腹血糖实验8周后与模型组比较均有较好的降血糖作用，而QJM(L)组降血糖作用不明显(P>0.05)。QJM(H)组和GGQL组血糖水平略有下降。QJM(H)组的降糖效果不如盐酸二甲双胍组，但两者表现出相似的降糖趋势(图1C)。在OGTT和TC实验中，模型组的AUC和TC值分别显著高于对照组(P<0.01)，而清健合剂、GGQL和二甲双胍组的AUC和TC值分别低于模型组(P<0.01)。QJM(H)与盐酸二甲双胍在OGTT或TC方面无显著性差异(P>0.05)(图1D，1E)。INS结果显示，模型组胰岛素水平高于对照组(P<0.01)，芪健合剂(H)组高于模型组(P<0.05)，芪健合剂(H)组高于二甲双胍组(P<0.01)。由于QJM(L)的降糖作用不显著(P>0.05)，因此我们重点比较了对照组、模型组、QJM(H)组和二甲双胍组的降糖作用，以揭示芪健合剂可能的机制。
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Control: C57/BL6 healthy control group; Model: Model group; QJM(L):Low Qijian Mixture group; QJM(H): High Qijian Mixture group; GGQL: Gegen Qinlian Decoction; Metformin: Western Positive Medicine group (metformin hydrochloride).FBG: Fasting Blood Glucose; OGTT: Oral Glucose Tolerance Test; TC: Total Cholesterol; INS: Insulin.
3. 5 组织学检查
对照组肝脏组织学检查图像显示，肝小叶结构清晰，肝细胞呈放射状分布于中心静脉周围(图2)。肝细胞大小和形态正常，中心有一个清晰的细胞核。肝细胞未见脂肪变性或坏死(图2A)。与对照组相比，肝小叶结构消失，肝索排列紊乱，肝窦增宽。模型组肝细胞脂肪变性、灶性坏死，并伴有炎性细胞浸润(图2B)。芪健合剂(H)组肝细胞索结构清晰，肝窦正常，胞浆内可见大小不一的脂滴，肝细胞局灶性脂肪变性(图2C)。与模型组比较，二甲双胍组肝细胞索结构清晰，肝窦正常，肝细胞胞浆轻度脂肪变性(图2D)。从肾脏组织学检查图像可以看出，对照组光镜下肾小球、肾小管和间质组织正常(图2E)。与对照组相比，模型组肾小球系膜细胞增生严重，肾小管上皮细胞空泡样变，球囊壁节段性粘连扩张(图2F)。QJM(H)组肾小球系膜细胞中度增生，肾小管上皮细胞轻度空泡样改变，球囊壁扩张较少(图2G)。与模型组比较，二甲双胍组肾小球系膜细胞轻度增生，空泡样20例，肾小管上皮细胞改变明显减轻，球囊壁少见扩张(图2H)，与模型组比较，二甲双胍组肾小管上皮细胞改变明显减轻(图2H)。这些结果阐明了大剂量芪健合剂和盐酸二甲双胍对肝、肾的损伤有一定的减轻作用。
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3.6 核磁共振氢谱分析代谢物
肝脏样品和对照组、模型组、QJM(H)组和二甲双胍组指定的代谢物的1HNMR谱如补充在线图2A所示，而补充在线图2B则显示肾脏样品的1HNMR谱。本研究中观察到的光谱频率与已知的共振频率相匹配，并对这些数据进行了多变量分析。
3.7 多变量数据分析和潜在生物标志物的选择
有14个特异性代谢生物标志物用于区分模型与对照组，17个用于QJM(H)与模型，14个用于区分二甲双胍与模型。代谢物包括异亮氨酸、缬氨酸、乳酸、丙氨酸、乙酸、高丝氨酸、戊二酸、3-羟基丁酸、谷氨酰胺、谷胱甘肽、胆碱、葡萄糖、牛磺酸、甘油、安息香、烟酰胺、黄嘌呤和肌苷，上述18种代谢物在4组(模型组、对照组、QJM(H)和二甲双胍)的热图如图4B所示。肾的VIP值>1.0和调整后的p值<0.05的代谢物如表2所示。有12个特异性代谢生物标志物用于区分模型与对照组，5个用于QJM(H)与模型，7个用于区分二甲双胍与模型。代谢物包括异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、乳酸、柠檬酸、sn-甘油-3-磷胆碱、三甲胺N-氧化物、肌醇、甘氨酸、葡萄糖、黄嘌呤、腺嘌呤和烟酰胺，上述13种代谢物在4组(模型组、对照组、QJM(H)组和二甲双胍)的热图显示在图4D中。
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3.8 通路分析
根据识别的生物标志物进行通径分析，糖尿病在肝脏中的主要代谢途径是V-Aline、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成；氨基酰tRNA的生物合成；丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代谢；以及半乳糖的代谢(图4A)。模型与对照、QJM(H)与模型、二甲双胍与模型的详细代谢途径显示在补充在线表3中。根据已确定的生物标志物，糖尿病在肾脏中的主要代谢途径是V-Aline、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成以及氨基酰tRNA的生物合成(图4C)。
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3.9 差异蛋白网络
除上述特征性变化的代谢物外，我们构建了代谢-蛋白质网络并鉴定了相关蛋白质，如图5
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3.10 肠道微生物的整体结构调控
4组共312个OTUS，对照组、模型组、QJM(H)组和二甲双胍组分别为251、41、61和274个专用OTUS(图6A)。经UniFrac PCoA加权分析，芪健合剂(H)组和二甲双胍组肠道微生物区系结构变化趋势一致，均远离模型组。说明芪健合剂(H)组和二甲双胍组肠道微生物区系结构恢复到对照组(图6B)。图6(C)显示了4个组的前10个门。种类最多的是类杆菌、放线菌和变形杆菌。图6(D)显示了4组前35个属的热图。
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3.11 4组微生物群落比较
Lefse是一个寻找高维生物信号和揭示基因组特征的软件。它的算法强调统计意义和生物相关性。LDA值分布的直方图显示设置了较大LDA分值的生物(默认设置)，这是组间统计差异的生物标记。它显示了不同群体中基因丰度的显著差异，直方图的长度表明了不同生物的影响程度(LDA得分)(图7A、C和E)。在进化分支图中，由内向外辐射的圆圈代表了从门到属的分类水平。每一分类中的小圆圈代表该级别的亚类，小圆圈的直径与相对丰度成正比。着色原理为：无显著差异的生物被涂成黄色，生物标志物按类群着色，红色节点表示在红色类群中起重要作用的微生物类群，绿色节点表示在绿色类群中起重要作用的微生物类群，其中红色节点表示在红色类群中起重要作用的微生物类群，绿色节点表示在绿色类群中起重要作用的微生物类群。
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3 .12 芪健合剂降血糖作用机制的系统研究
通过文献检索，共发现95种化学成分和207个潜在的蛋白质靶点。检索到的化学成分包括黄芪多糖、黄芪甲苷、异黄芪甲苷、黄芪总皂甙、红花黄芪甲苷、山奈酚、异鼠李素、萼黄素、槲皮素、三羟甲基吡啶、小檗碱、黄铜、大豆苷元、葛根素、染料木素、芒柄花素、黄芩素和葛根素。在这些目标中，有133个目标被确定与糖尿病有关。通过UniProt数据库映射(http://www.uniprot.org/))进行归一化，结果显示智人包含11个靶点。在图8(A)中，以中等概率置信分数=0.400检索到的蛋白质目标与11个预测的功能伙伴(全部具有置信分数=0.999)一起被呈现为交互网络中的节点。网络节点指示蛋白质靶标或相关基因。根据网络统计，平均节点度为12.2，显示有35个枢纽(补充在线表7)。TP53枢纽的程度最高，为53度，其次是AKT1和PPARA枢纽，分别为46度和45度。这些中枢，特别是TP53、AKT1、PPARA、MTOR、NOS3、CCND1、MAPK1和MAPK3，已经被描述为与2型糖尿病有关[39-42]。此外，相互作用网络的作用观点显示，芪健合剂可激活其所有功能配对，但与CCND3、NFKB1A、AXIN1和TCF7L2结合并抑制。气健合剂还参与了接受的27号手稿的催化、翻译后修饰、反应和表达。此外，ClueGO介导的富集分析进化为对GO项的显著富集，这些GO项被分为9类。这些亚群主要参与半乳糖代谢过程、己糖跨膜转运、脂质转运的负调控、次生代谢途径、铵离子代谢过程、黄酮代谢过程和蛋白质ADP-核糖化(补充在线表8，图8B)。这些观察结果有助于更好地理解芪减合剂的作用机理。
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4. 讨论
糖尿病令人痛苦的并发症，以及目前的治疗方法不能全面治疗糖尿病及其并发症，说明了寻找有效的治疗方法的迫切需要。经过几百年的实践，中医药治疗T2D的疗效已得到证实[38]。本研究首次发现芪健合剂与肉桂醛[43]、天然二苯乙烯类[44]、泽泻提取物[45]等天然化合物相似，具有良好的降血糖作用。文献中未见有关芪健合剂疗效和安全性的研究报道。本研究提示芪健合剂治疗组与未治疗组相比，对FBG有明显的抑制作用。大剂量芪健合剂能显著降低胰岛素水平、口服糖耐量和TC水平；这些结果与先前报道的另一种中药葛根芩连汤的研究结果一致[38]。本研究中二甲双胍的降糖效果最好，清降糖脉冲剂(H)组的降糖趋势与之相似。QJM(H)组口服葡萄糖耐量试验(OGTT)与二甲双胍组接近，并接受28TC水平，同时，QJM(H)组胰岛素水平明显高于二甲双胍组(P<0.0 5)，而QJM(H)组与二甲双胍组比较差异无显著性(P>0.0 5)。此外，组织学检查显示芪健合剂(H)组炎症略有减轻。这一观察结果与报道的葛根芩连汤治疗糖尿病小鼠的核磁共振研究是一致的[46]。从这些数据可以明显看出，使用中草药配方可以有效地控制血糖水平。（确定能够降糖，并且无毒副作用）
测定降糖潜力后，用代谢组学方法评价芪健合剂的作用机制。在这项分析中，收集了肝脏和肾脏样本，并鉴定了处理组中发生深刻变化的代谢物。结果表明，芪健合剂治疗后的主要代谢物为异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、柠檬酸、乳酸、丙氨酸、醋酸盐、高丝氨酸、戊二酸、3-羟丁酸、谷氨酰胺、谷胱甘肽、胆碱、sn-甘油-3-磷酸胆碱、葡萄糖、牛磺酸、甘油、安丝氨酸、烟酰胺、黄嘌呤、肌苷、三甲胺n-氧化物、肌醇。亮氨酸、异亮氨酸和维生素A是具有支链的必需氨基酸。这些氨基酸主要对胰岛素对骨骼肌氨基酸去除的抑制作用作出反应。在糖尿病的情况下，这些氨基酸的新陈代谢发生了很大的变化[47]。特别值得一提的是，亮氨酸介导的胰岛素释放刺激促进了蛋白质的合成并抑制了蛋白质的降解[48]。此外，丙氨酸调节葡萄糖代谢，因此丙氨酸水平总是与血糖水平成正比[49]。由于芪健合剂治疗组血清亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸水平均高于对照组（应该是低于？），故本研究表明芪健合剂可通过降低亮氨酸、异亮氨酸、V-脯氨酸、丙氨酸水平，对氨基酸代谢的调节产生调节作用。（代谢物的变化，但是最后一句话好像有些问题）
通过构建代谢相关网络，芪健合剂合剂相关的55个蛋白质以及与之相关的4条信号通路，即半乳糖代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解代谢、氨基酰tRNA生物合成代谢以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径，进一步探讨芪健合剂的作用机理。很明显，这些已鉴定的途径与试验组的代谢物图谱是一致的。此外，半乳糖代谢不仅对细胞内能量的产生很重要，而且对糖脂和糖蛋白的修饰也有贡献[50]。V-Aline、亮氨酸和异亮氨酸的降解代谢与胰岛素敏感性有关：血清中V-Aline、亮氨酸和异亮氨酸水平的增加促进了胰岛素敏感性的损害[51]。氨基酰tRNA被发现与神经退行性疾病有关[52]。丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径参与代谢综合征的发病，如T2D[53]。由此可见，这4条途径与T2D密切相关，证实了芪健合剂对T2D的治疗潜力。（芪健合剂途径）
芪健合剂除改善血糖控制外，还改变了微生物组成。各种各样的研究已经描述了益生菌[12]、药物[17]和食物[54]在代谢性疾病中对肠道微生物区系的调节作用。例如，二甲双胍治疗的HFD诱导的肥胖小鼠表现出阿克曼氏菌的增加。在降低血糖的过程中[55]。芪健合剂的主要成分是小檗碱，它参与了富含短链脂肪酸的过程，与预防胰岛素抵抗和大鼠体重增加有关[17]。葛根是芪减合剂的主要成分。然而，文献调查显示，小檗碱和葛根对肠道微生物区系的调节作用尚未见报道。因此，本研究在芪健合剂或其组分对肠道微生物区系调控方面尚属首次。（芪健合剂作用于肠道微生物）
不同剂量芪健合剂对T2D有不同程度的缓解作用。同样，肠道微生物区系调节的程度也取决于芪健合剂的剂量。这表明，T2D的改善与肠道微生物区系的调节密切相关。益生菌研究也报道了肠道微生物区系以剂量依赖的方式调节。例如，随着低聚半乳糖剂量的逐步增加，双歧杆菌的数量也随之增加[56]。目前的研究表明，大鼠肠道微生物区系的调节和T2D的改善都依赖于给药剂量。此外，肠道微生物区系的修饰导致了T2D的改善，认为芪健合剂介导的肠道微生物区系的改变可能是糖尿病病情缓解的原因。
冗余度分析表明，芪健合剂处理对固氮菌和类杆菌等几种可能有益的细菌有一定的影响，富集了类杆菌。这些细菌的抗炎作用部分是通过减少肠道细胞因子的产生和促进抗炎细胞因子的分泌来实现的[57]。与非糖尿病肥胖者相比，糖尿病肥胖者的纤毛虫含量较高，类杆菌含量较低。这种肠道微生物区系的转移不仅由于血浆脂多糖(LPS)水平的增加而引起炎症，而且还减少了胰高血糖素样肽2(GLP-2)的合成。GLP-2促进细胞紧密连接，减少LPS进入血浆。因此，肠道微生物区系的改变导致GLP-2水平降低，导致肠道通透性和血浆内毒素浓度增加[58]。LPS水平的升高有助于TLR4的激活和促炎细胞因子的上调，触发了炎症反应，最终导致肥胖和T2D[58]。肠道微生物区系的移动与炎性细胞因子呈负相关[57]。在本研究中，观察到类杆菌与空腹血糖呈负相关，表明类杆菌与T2D缓解之间可能存在潜在的关联。
系统药理学为中医研究提供了简单的范例，以评估药物作用的多靶点影响和生物网络功能的理论感知[20]。为了更好地了解芪健合剂治疗T2D的分子模式，在网络药理学的基础上建立了蛋白质相互作用网络。它由95种化学成分、207个分子靶点及其9个相应的功能注释组成。分析表明，同一化学品或不同化学品作用于同一目标的多个目标更有可能影响整个网络的平衡，这使得芪健合剂的治疗更有效。
中国的医疗体系有着悠久的中药历史，中药是几种活性化学物质的混合物。由于中药化学成分复杂，其作用机理尚不清楚。目前的研究描述了一种新的中药，芪健合剂的有效性和安全性，它可能通过肠道微生物区系调节，在T2D中表现出改善作用。芪健合剂中含有芒柄花素、毛萼花素、葛根素等活性成分。Formononetin 是一种异黄酮，通过刺激胰岛素释放发挥降血糖作用[59]。Calycosin可改善糖尿病及其相关并发症，如认知障碍[60]。葛根素是一种膳食黄酮，通过其对β细胞存活和GLP1受体途径的作用，使血糖水平正常化，并改善糖耐量[61]。这些化合物可能会对肠道微生物区系产生影响，但文献调查没有显示任何这类研究。芪健合剂也含有碳水化合物，这可能会影响肠道微生物区系，从检测到少量的膳食纤维可以看出这一点。此外，不同浓度芪健合剂碳水化合物的含量也是相似的。其他碳水化合物成分，例如淀粉，在进入结肠之前被消化和吸收。这些发现确定了芪健合剂成分对肠道微生物区系的调节可能与改善血糖控制有关。因此，由于其潜在的肠道微生物区系，芪健合剂可以作为一种新的药物用于治疗糖尿病。（芪健合剂的作用物质基础）
5. 结论
上述结果描述了芪健合剂对T2D的治疗潜力。采用基于1H-NMR的代谢组学方法，结合多元数据分析，对芪健合剂的作用机理进行了研究。
芪健合剂具有调节氨基酸和碳水化合物代谢中不同代谢物的浓度，使代谢表型正常化，调节代谢紊乱的作用。
利用代谢产物生物标志物鉴定气健合剂相关蛋白及其相关途径。检索到的通路显示气健合剂与T2D密切相关。
上述结果还表明，中药组方芪健合剂可引起肠道微生物区系结构的改变。这些变化与芪健合剂的降糖作用有关。特别是，这种植物处理导致了有用细菌的富集，包括肠道中的类杆菌。
基于目前积极的降血糖作用，从更深层次的研究角度出发，我们希望评估以下几个方面：
1)基于概率系综法，芪健合剂中可能的不同单体组合对T2D的影响，以改进混合物，提高效果；
2)从系统药理学角度预测蛋白质的最佳单体组合在细胞和小鼠水平上的调节机制；
3)适合于检测蛋白质、调节途径和微生物区系之间的系统关系的方法，不仅限于体外，而且还可以用来检测蛋白质、调节途径和微生物区系之间的系统关系。
不足：本文基本全是组学检测，缺乏验证。
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