文章概览
题目：Single-cell RNA-seq supports a developmental hierarchy in human oligodendroglioma
中文题目：单细胞转录组分析揭示了人类少突胶质瘤的发育层次
第一作者：Itay Tirosh, Andrew S. Venteicher
通讯作者：Aviv Regev, Mario L. Suvà
（作者里面拿出任何一个人来都是一本教科书。。。）
日期：2016.11.10
被引次数：530
期刊：Nature
影响因子：42.778
引言
肿瘤干细胞（Cancer Stem Cell, CSC）在在高级别（WHO III-IV 级）的胶质瘤中已经得到验证和分离[1]，但在小鼠实验和异种移植的结果中却引发了争议，因为它不能模拟体内真实的肿瘤微环境。此外，在低级别的胶质瘤中是否存在CSC目前也是未知的[2]，这是理解胶质瘤起始阶段的关键。
样本信息
本文对六个未经处理的 II 级少突胶质细胞瘤（Oligodendroglioma）进行了单细胞测序，六个样本均具有IDH1或IDH2突变和 1p/19q 共缺失得到证实。总体来说，本研究分析了 4,347 个经过QC的细胞。对样本MGH36，MGH53，MGH54（ 791 至 1,229 个细胞）进行了深入的分析对样本MGH60、MGH93和MGH97（ 430 至 598 个细胞）进行了中等深度的分析。样本信息如下图所示。
图1 样本信息
CNV分析
作者通过从每个细胞内染色体区域中基因的平均表达估计拷贝数变异（CNV）来区分恶性细胞和非恶性细胞。结果显示，每个样本的大部分细胞都具有 1p/19q 染色体的共缺失，以及一些肿瘤特异性 CNV，这些都通过荧光原位杂交 (FISH) 和全外显子组测序 (WES) 进行了验证。在样本MGH36和MGH97中，CNV分析鉴定出了两个样本内的亚克隆。
图2 CNV分析
而有303个细胞没有发现CNV，通过基因表达成分别鉴定为小胶质细胞（Microglia）和成熟少突胶质细胞（OC），而且作者发现小胶质细胞内部的基因表达存在明显的差异，不同于标准的M1/M2类巨噬细胞的特征，表明这可能是胶质瘤中特异的小胶质细胞特征。
方法
位置 j 处细胞 i 的 CNV 估计定义为
CNV 定义
CNV0 是通过按染色体某个位置所对应窗口内的平均基因表达量计算得到的，将所有高于 3 的值替换为 3，并将低于 -3 的值替换为 -3，将相对表达值限制在 [-3,3]，BaseMax和BaseMin表示非恶性细胞基因表达平均值的最大值和最小值。
PCA分析
然后，作者利用改进的PCA对每个样本进行降维（图3c），发现PC1分数高的细胞对应137个基因的高表达，包括OC相关基因（如OLIG1, OLIG2, OMG），和128个基因的低表达，包括AC相关（如APOE, ALDOC, SOX9）；而PC1分数低的细胞则表现相反。这表明少突胶质细胞瘤由两个胶质细胞的亚群构成（图3d）。
图3 恶性细胞的PCA分布
具有高PC2和PC3分数的细胞具有中等PC1分数，表明它们缺乏分化。总共有63个基因与高的PC2和PC3分数相关，排名前20的基因包括SOX4, SOX11和SOX2，有文献证实他们是神经干细胞（NSC）和胶质瘤干细胞（GSC）的关键转录因子。此外，NFIB, ASCL1, CHD7, CD24, BOC and TCF4也被证明与GSC有关。艾伦人脑图谱的结果显示，PC2和PC3相关调节因子的表达在产前人类大脑中最高，出生后显着下降，表明这些基因在早期神经发育中起重要作用（图4）。基于这些证据，作者将具有中等 PC1 值的细胞分为“未分化”（低 PC2 和 PC3）和“干细胞/祖细胞”（高 PC2 和 PC3）细胞。
图4 PC2 和 PC3相关基因的表达
为了准确地为每个肿瘤细胞定义细胞状态，作者定义了分化和干性评分。在所有六种肿瘤的细胞上通过这些分数表示细胞显示与胶质细胞正常发育轨迹的相似性，即从干细胞/祖细胞程序分化为两个神经胶质谱系（图5d）。在六个样本都观察到了相同的结构，并且使用不同的测序平台也发现了相同的结构（图5e）。
方法
OC 和 AC 谱系基因集分别被定义为具有更高 OC 表达的 PC1 正相关基因和具有较高的 AC 表达 PC1 负相关基因。细胞 i 谱系分数定义为细胞 i 的谱系基因集平均相对表达量减去对照基因集的平均相对表达量，即：
Lineage score的定义
其中，Lin(i,j) 是细胞 i 属于谱系 j 的得分，G(j) 是谱系 j 的基因集，G(j)cont是谱系 j 的对照基因集（control）. 对照基因集的选择是首先将所有 8008 个分析的基因分成 25 个bins，然后对于谱系基因集G(j)中的每个基因，从相同的bin中随机选择 100 个基因。这样，对照基因集G(j)cont具有与谱系基因集G(j)相当的表达水平分布，而对照基因集要大 100 倍，such that its average expression is analogous to averaging over 100 randomly selected gene sets of the same size as the lineage gene set. 最终，细胞 i 的谱系得分被定义成两个谱系得分的最大值。
当然，会存在很多得分小于0的细胞（既不像OC也不像AC）。为了做图，作者将这些细胞的得分先随机分配到(0, 0.15)，以防x=0出现很多重合的点，然后将AC谱系得分高的细胞的谱系得分取相反数，OC谱系得分高的细胞取本身。例如，细胞 i 的Lin(AC)=1, Lin(OC)=0.1，则细胞i的最终谱系得分Lin(i)=-1。这样，就得出了所有细胞的Lineage score。
Stemness score的定义方法与Lineage score类似，首先选择与PC2和PC3正相关的基因，去除核糖体基因作为干性基因集。细胞 i 的干性得分Stem(i) 定义为细胞 i 干性基因集的平均表达减去对照基因集的平均表达，再减去谱系得分。
Stemness score的定义
图5 分化和干性评分
细胞分类
对于每个细胞可以计算以上三个score（两个谱系得分和一个干性得分），如果最大分数高于 0.5 并且比其他程序的分数高出 0.5，则将这个细胞定义为stem/progenitor-like, OC-like或AC-like，而最大分数未通过这些阈值的细胞被定义为undifferentiated。作者提到，大多数的细胞高度偏向于三种状态之一。
细胞周期分析
作者还对细胞周期基因进行了评分，发现几乎所有增殖的癌细胞都局限于肿瘤的“干/祖细胞”和“未分化”亚群，表明这些细胞是少突胶质细胞瘤的“燃料仓”。
图6 细胞周期分析
方法
作者从人类 (293T) ，小鼠 (3T3) 细胞系，小鼠造血干细胞以及HeLa 细胞的研究中 43 个 G1/S 和 55 个 G2/M 基因集。cycling细胞被定义为这两个基因集至少其中一个的表达超过所有细胞的2倍并且t检验的P value < 0.01
CNV分析和突变分析
最后，作者对CNV的亚克隆进行了分析，MGH36 的克隆 1 和 MGH97 的克隆 2 中cycling细胞的比率更高，这与它们增加的干/祖细胞比率一致
图7 CNV亚克隆分析
通过scRNA-seq的SNV分析，作者确定了CIC的亚克隆突变，CIC基因是少突胶质细胞瘤中已知的肿瘤抑制因子。作者设计了一种突变敏感的 qPCR 测试方法，确定了28 个CIC基因突变的细胞和 27 个野生型CIC细胞。同时确定了突变CIC和野生型细胞之间表达变化的特征（图8d），包括先前报道的ETV1和ETV5。突变CIC和野生型CIC细胞在所有三个亚群中都存在（图8c），因此，许多亚克隆突变可以在发育层次中产生，但却不是驱动因素。
图8 突变分析
总之，我们的结果强调了这样一个事实，即少突胶质细胞瘤中有一个未分化细胞亚群，它们具有干细胞表达特征和丰富的增殖潜力。因此，最原始和未分化的癌细胞群可能是少突胶质细胞瘤增殖细胞的主要来源。尽管我们不能排除基因突变的影响，但许多亚克隆事件跨越了这三个状态，这与该体系结构主要由非基因发育计划所决定。我们工作的一个警告是，由于II级少突胶质细胞瘤细胞在异种移植中不生长，因此我们无法在功能上验证茎/祖细胞程序，而是从与分化程序的反向关联中推断其功能，丰富的增殖和与正常茎/祖细胞的相似性。我们的单细胞图谱表明少突胶质细胞瘤干细胞/祖细胞更类似于原始的三能神经细胞类型，如 NSC 或 NPC，而不是像 OPC 等更定型的神经胶质祖细胞。通过提供少突胶质细胞瘤中癌症干/祖细胞的全基因组转录特征，我们的工作描绘了代表影响肿瘤生长的有希望的靶标的细胞程序。需要进一步的研究来功能验证我们的发现，询问它们在其他神经胶质瘤亚型中的普遍性，并调查临床转化的机会。
参考
[1] Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L. & Rich, J. N. Cancer stem cells in glioblastoma. Genes Dev. 29, 1203–1217 (2015).
[2] Friedmann-Morvinski, D. et al. Dedifferentiation of neurons and astrocytes by oncogenes can induce gliomas in mice. Science 338, 1080–1084 (2012).
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