本文选自Journal of Hepatology，https://doi.org/10.1016/j.jhep.2020.04.044，喜欢的朋友可以自行下载阅读。
不废话，上图。
在慢性肝损伤中，血小板衍生生长因子(PDGF)刺激的肝星状细胞(HSCs)释放纤维化的胞外小泡(EVs)。EVS包括多囊泡体(MVB)衍生的外切体和依赖Rho相关激酶(ROCK)的质膜萌发衍生的微囊，本文着重介绍了HSC在损伤时，通过自噬作用，抑制了EV的释放从而减轻了纤维化进程。PDGF及其下游分子SHP2(Src同源2蛋白酪氨酸磷酸酶2)抑制自噬并增加HSC来源的EV的释放。使用这个PDGF/SHP2模型进一步研究自噬如何影响纤维化EV的释放。RNA-seq发现了一个受SHP2和PDGF调控的mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶标)信号分子。mTOR信号通路的中断可消除依赖PDGF的EV释放。激活mTOR信号通过激活ROCK1信号抑制自噬和促进微囊泡，从而诱导MVB衍生的外切体的释放。这些mTOR依赖的EV可促进HSC在体外的迁移。
首先，作者验证了PDGF可以抑制自噬，并促进EV释放。作者用的是自噬常用的慢病毒载体mCherry-EGFP-LC3B(Human) 慢病毒滴度液。自噬过程中会由蓝变红，红色越多，自噬越多。可见PDGF抑制了自噬，但是PDGF增加了LC3b和P62的蛋白水平。也说明了自噬受到了抑制。PDGF增加了细胞内MVB的量，在鼠细胞中同样的结果。PDGF下游信号SHP2，其抑制剂SHP009,可以抑制PDGF促进的EV释放，SHP099还降低了LC3b蛋白水平，表明抑制SHP2促进了自噬降解。
这个不应该是Green/Red吗？还有这两个自噬的条带，为什么家用PDGF是LC3II/I的比例更高了，这不是促进自噬了吗？
作者利用PDGF/SHP2模型进一步研究自噬如何抑制纤维化EV的释放。为此，进行了HSC全转录组RNA测序，用了SHP009后有25%的基因上调了，有几条途径受到SHP2抑制的影响，其中最高的一条是骨关节炎。这一过程与纤维化有许多相似之处。因此，qPCR进一步证实了候选的骨关节炎途径。因此，内源性mTOR抑制剂Redd1是SHP2的主要靶点之一(mTOR抑制剂会促进自噬)。在先前的研究中，mTOR促进肝损伤和纤维化，并抑制自噬。在这里，PDGF抑制Redd1的表达通过SHP2抑制恢复的。作为对照，转化生长因子β没有降低Redd1，提示Redd1受PDGF1/SHP2轴的特异性调节。接下来，通过刺激Redd1的表达来了解其在肝纤维化和HSC来源的EV释放中的作用。使用了Redd1刺激物，氯化钴(CoCl2)。Redd1的表达减弱了PDGF介导的EV释放，但对EV大小没有影响。接下来，我们在Lx2细胞中过表达Redd1(图2D，左侧)。与先前的结果一致，过度表达Redd1显著减少了HSC来源的EV的释放。综上所述，这些结果表明，自噬激活剂和mTOR抑制剂Redd1是HSC来源的纤维化EV释放的负调节因子。
为了进一步了解自噬如何影响纤维化EV的释放，作者研究了自噬抑制剂mTOR在HSC来源的EV释放中的作用。雷帕霉素通过降低mTORC1下游信号分子核糖体蛋白S6激酶(S6K)的磷酸化水平来证实雷帕霉素对mTOR信号转导的影响，而PDGF的作用是通过下调PDGFRmRNA的水平来证实的，雷帕霉素抑制mTOR可以减弱PDGF介导的EV释放，而对EV大小没有任何影响，作者进一步对mTOR通路上的一些蛋白进行了敲减，得到一致性结果。真是不理解做这个有什么意义。
作者研究了mTOR信号在外切体释放中的作用。PDGF增加了p62蛋白水平，该蛋白水平被雷帕霉素减弱，提示PDGF通过mTOR抑制自噬。巴菲霉素A1或自噬相关5(ATG5)siRNA抑制自噬显著增加了纯化EV组分中的外体标记CD81和微囊标记Arf6。基于这些结果，研究了mTOR信号在原代HSC MVB池中的作用，其中CD63是MVB和外切体的标记。免疫荧光显示，PDGF处理细胞增加了MVB池，该池被雷帕霉素消除。与此相一致的是，雷帕霉素减少了PDGF介导的外切体释放，表现为EV组分中CD81和CD63蛋白水平的降低。这些结果表明mTOR信号诱导外切体释放.与外体不同，微囊释放依赖于ROCK1的活性。因此，作者接下来研究了mTOR信号对ROCK1活性和微囊释放的影响。PDGF处理HSC激活了ROCK1信号，磷酸化的ROCK1下游信号分子肌球蛋白磷酸酶靶向亚单位1(MYPT1)水平的增加证明了这一点，表明外体和微囊释放机制之间存在交叉。PDGF介导的ROCK1活性也被雷帕霉素抑制，MYPT1磷酸化减弱表明PDGF通过mTOR诱导ROCK1激活。不理解这个微囊做着又有什么意义。
Fasudil是ROCK抑制剂
综上所述，mTOR信号通过抑制MVBs的自噬降解诱导外体释放，通过激活ROCK1信号诱导微囊释放。
受体酪氨酸激酶(RTK)信号在纤维化中非常重要，作者进一步研究了EV中磷酸化RTK的含量变化。原代HSCs分别用溶剂、PDGF、雷帕霉素或PDGF+雷帕霉素处理，12h后收集EV。阵列结果显示，PDGF处理后的EVS中存在多种磷酸化RTK，如成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)、内膜内皮细胞激酶(TIE2)、间变性淋巴瘤激酶(ALK)和受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)。上调最多的mTOR依赖激酶(被PDGF上调，被雷帕霉素下调)是磷酸化FGFR3，它是一种参与成纤维细胞迁移的RTK。这些数据表明，mTOR信号不仅促进EVS的释放，而且通过激活的RTK介导EVS的富集，接下来检查了这些富含RTKs的EV对HSC迁移的影响，与来自PDGF+雷帕霉素处理细胞的EV相比，来自PDGF+雷帕霉素处理细胞的EV显著增加受体HSC的迁移。
由于SHP2是mTOR依赖的EV释放的上游调节因子，我们检测了肝硬化患者的SHP2水平。在全肝裂解液中，与健康人相比，肝硬化患者的SHP2增加。PDGFR是我们机制中的一个重要组成部分，主要由间充质细胞(肝星状细胞和肌成纤维细胞)表达，作者进一步研究了肝星状细胞特异性SHP2缺失在小鼠肝纤维化中的作用，这里用了转基因鼠，PDGFR CreT2小鼠与SHP2f1/f1小鼠杂交获得 PDGFR βCreERT2 /SHP2 fl/fl mice。通过将PDGFRβCRERT2小鼠与ROSA26-Tomato15Stop-GFP小鼠杂交，证实了creert的有效性。在后代中，当他莫昔芬给药时，在PDGFRGFP+细胞中，CreERT进入细胞核并删除导致绿色荧光蛋白表达的tomato停止序列，而在其他细胞中只表达tomato基因。鉴定GFP+细胞位于非实质位置。通过α平滑肌肌动蛋白(α)免疫荧光证实，肝脏中74%的α平滑肌肌动蛋白+HSC细胞表达CRERT2型.这就是转基因模型的构建过程。
下面的过程就很简单了，作者进一步在动物水平看看SHP2缺失条件下对于CCl4诱导肝纤维化的影响。但选择性敲除HSC中的SHP2（SHP2 ∆HSC mice）时纤维化程度明显减轻。这个橄榄油就神奇了，为什么会是反着的结果。SHP2fl/fl的就没有这个作用。接下来调查了HSC特异性SHP2如何影响循环EV的纤维化潜能，以及这些EV如何影响体内的肝纤维化。首先，我们研究了EV摄取的细胞特异性。将Lx2细胞产生的标记EV腹腔注射给受体野生型小鼠，24小时后用双重免疫荧光染色检测肝脏。结果显示EV与HSCs、巨噬细胞和内皮细胞共存，提示EV被这些类型的细胞摄取。然后，供体小鼠，SHP2∆HSC小鼠或SHP2FL/FL仔鼠对照，接受橄榄油或CCl4 6周，然后分离循环中的EVS。小鼠循环中的小EVS浓度为1010EVS/mL。为了避免大量EVS超负荷的潜在副作用，每天将来自每个供体组的生理盐水或2x108个EVS联合CCl4腹腔注射到WT小鼠体内，持续4周。与生理盐水注射相比，经橄榄油处理的SHP2FL/FL或SHP2HSC供体小鼠的EVS不影响肝纤维化。
本文到此结束了。感觉乱乱的，有一条主线，中间侧枝横生，每个东西都有点作用，但是每个机制都不深入。作者可以少做点别的，把一个机制做的更深入点试试会不会更好点。欢迎批评、指正。
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