研究背景
多发性硬化症 （MS） 是一种复杂的炎症和神经退行性脱髓鞘神经系统疾病，其特征是多灶性病变和闷烧性病变，影响全球约280万人。其主要症状包括活动能力和认知受损、疲劳、麻木、视力问题、抑郁和协调性差。目前虽然单细胞分析提供了对神经病理学的见解，但MS背后的细胞过程及发病机制仍然知之甚少，缺乏在整个疾病过程中的真实细胞丰度、空间分布和细胞间相互作用的了解。就MS目前的研究现状，有学者进行了题为《Single cell-resolution in situ sequencing elucidates spatial dynamics of multiple sclerosis lesion and disease evolution》的研究，研究者以小鼠为动物模型，通过检查实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠模型中疾病进展的时间和区域速率来模拟MS的细胞间相互作用以及MS病变和整体神经病理事件的时间顺序特征对于阐明疾病在不同 MS 患者队列中发展的重要性。
研究亮点
研究者使用Xenium亚细胞空间原位分析选择人脑panel中266个基因对多发性硬化症的颈脊髓样本进行靶向检测，进而构建单细胞分辨率的细胞空间图谱，注释了病变演变过程中的疾病邻域，发现了活动病变的离心传播。在数据分析部分，没有复杂的多种数据联合分析，而是仅基于Xenium数据，识别患者组织切片中的不同病理区域，进而再深入探究各个区域的细胞组成和转录特征，从而证明了疾病相关（DA）胶质细胞是动态的，并且在病变形成之前独立于病变诱导；同时证实了DA-胶质细胞的差异分布，能够将活动性和非活动性病变分解为亚区室，并识别新的病变区域。通过以单细胞分辨率建立小鼠和人类MS神经病理学的空间资源，研究揭示了MS疾病进化背后的复杂细胞间相互作用。
研究思路
研究结果
1.原位测序（ISS）解析EAE小鼠中主要细胞群和状态
MS 的特征是多灶性病变和正常出现的白质和灰质区域的隐性病变。研究者首先在MS的EAE小鼠模型中利用直接RNA靶向的ISS来探测疾病诱导后不同时间点出现的早期，急性和解决的炎症病理。然后在空间上表征了与这些过程相对应的细胞相互作用（图1A）。之后为了捕获炎症不同阶段的病变并建立病变发展的假时间，检查了EAE高峰期和晚期的不同CNS解剖区域；在对照、高峰期和晚期EAE样本的所有选定解剖区域进行ISS分析后，共检测到499,978个细胞（其中;178,435个来自脊髓，321,543个来自脑切片），通过层级聚类和细胞注释，得到41个细胞类群。然后对注释到的神经元，胶质细胞，免疫细胞等主要的细胞群进行亚群细分，并发现有些独特的细胞亚群表现出对特定解剖区域的空间偏好，某些解剖区域和神经元束可能更容易受到病变发展和慢性的影响。
图1
2. 探究EAE小鼠五个不同病理区室的细胞组成和免疫及炎症特征
EAE 病变通常根据反映免疫浸润的细胞核密度增加、病变富集小胶质细胞、巨噬细胞和/或髓磷脂丢失的免疫染色来识别，这种方法在病变和非病变组织之间提供二元区分；所以研究者选择通过分析细胞邻域来更精确地识别病变甚至微小的病理变化。研究者基于23种主要指定细胞类型的分析（图1B），并精准地探测了它们在脊髓和脑组织切片中形成的邻域类型（图2A）。检查了每个细胞周围的局部邻域，定义为100μm半径，为每个细胞生成一个邻域矩阵，然后对其进行聚类和注释（图2A-C）。对照大脑的分析，研究者还区分了胼胝体、皮层、脑膜周围的隔室、心室层、纹状体以及覆盖隔膜核、下丘脑和无分体的隔室 （SN_HY_SI），从而证实了无偏计算方法可以精准识别具有不同细胞组成的区室。最终完成对五种不同的疾病诱导的病理区室类型;一个对应于大脑中免疫浸润的胼胝体区域，三个在EAE高峰期时大量分布在整个脊髓白质的分析，并发现第五个隔室仅存在于EAE晚期的腰椎脊髓中（图2C）。
图2
3. 探究EAE峰值时脊髓病变区室的空间分布差异
在EAE脊髓峰值内发现的病理区室在其细胞邻域和组织内定位方面也不同。研究者根据这些隔室在具有完全发育的复杂结构的病变中的分布（图3B-C中的病变III期）注释为：1）病变核心区室（LCC），2）病变边缘区室（LRC）和3）病灶周围区室（PLC）（图2C）。病变核心区室（LCC）被定义为存在于复杂病变的中心（图2C），并且MC / d细胞和DC的丰度最高（图2D，E）。DA-MiGL显示出相同的趋势，但在病变核心区室内也相对突出，尽管其他单核细胞来源的吞噬细胞在该区域中明显更丰富（图2D，E）。随着脊髓内免疫浸润和增殖的增加，病变区室化并经历同心离心扩张，但在到达灰质时似乎被阻断（图3B-C）。
图3
4.深入研究DA胶质细胞转录特征
与CFA对照相比，EAE峰值的脊髓不仅表现出局灶性隔室，而且表现出细胞组成的整体改变（图4A）。这些变化在解剖学隔室的水平上已经很明显。GM和WM由免疫细胞和疾病相关胶质细胞组成（图2D-E，4A，B），这与正常出现的白质和灰质已经在小胶质细胞，星形胶质细胞和少突胶质细胞群体中表现出疾病特征的概念一致（图4D）。发现DA-MiGL表现出与其激活相关的稳态MiGL标志物和上调膜蛋白的表达降低，包括MHC基因，特别是B2m和Cd74，如之前在活化小胶质细胞中研究结果一致（图4C)。最终表明神经胶质细胞在早期炎症时开始以局部方式获得DA特征，但最终受到周围环境影响，可能是由于可溶性细胞因子从病变或通过广泛破坏的BBB的扩散。
图4
5. ISS与scRNA-seq的联合探究DA-glia在EAE所有阶段细胞间相互作用
虽然单细胞转录组学数据集中的受体-配体对已被广泛用于推断细胞-细胞相互作用，但伴随研究不断深入，同样也带来一些新的挑战。由于每个细胞的天然位置都保留在先前研究的 ISS 数据集中，研究者根据它们的接近程度探索细胞之间的真实相互作用（图 5A）。首先，研究者通过连接每个像元的 5 个最近的空间分量来计算空间邻居图。这能够查看不同细胞类型之间形成的连接数量（图5C）以及富集评分（z-score），其中观察到的连接数与一组随机排列的连接进行比较（图5A，D）。在EAE峰值的大脑中研究者观察到，最常见的相互作用是神经元和稳态胶质细胞之间，以及神经元和脉管系统之间（图5C）。在EAE脊髓峰值内，病变富集的免疫细胞形成了一个独特的枢纽（图5D）。研究者观察到单核细胞，树突状细胞和T细胞与其他细胞类型的分离，与病变核心区室（LCC）的形成一致（图5D）。在晚期腰椎脊髓内，免疫中枢得以保留，但发现特别是MC / d细胞与DA-MiGL显着相互作用，表明它们共享生态位。DA-少突胶质细胞（DA-MOL2）与DA-星形胶质细胞和DA-小胶质细胞的关联也存在，这可能表明新生成的MOL可能仍会获得DA状态，因为DA-星形胶质细胞和DA-小胶质细胞的存在在解决LLC中的炎症。最终确定DA-glia是EAE跨区域和阶段的循环相互作用中心。
图5
6.Xenium亚细胞空间原位分析技术构建人类MS的空间细胞图谱
为了将EAE发现与多发性硬化症（MS）患者的脊髓病理相关联，研究者对两个注释为活动性和非活动性损伤的人颈脊髓切片进行了Xenium亚细胞空间原位分析检测。Xenium技术使用了有着266个基因的人脑基因panel（与生理和病理状况有关的细胞类型和状态的靶点）进行靶向检测。共鉴定了240,372个细胞，这些细胞平均表达144±95个转录本和49±18个差异基因。根据聚类分群和注释结果，确定了38种细胞群，包括主要的胶质细胞(星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞和雪旺细胞)、免疫细胞(巨噬细胞、淋巴细胞)、神经元、血管和室管膜细胞（图6C-E）。其中一些细胞类型具有空间偏好性，比如灰质(GM)富集较多的神经元和血管软脑膜细胞。此外，星形胶质细胞和少突胶质细胞亚群MOL_Opalin偏好分布在GM中，而少突胶质细胞亚群MOL_Klk偏好分布在白质（WM）中。推测GM和WM的特异环境可以诱导不同的少突胶质细胞状态，或者这些区域内的神经元需要特定的少突胶质细胞的支持。
图6
7. 解析人类MS的特定空间病变区域的病理变化与小鼠EAE模型中的分布相似
最后研究者基于Xenium数据进行领域分析获得不同的病理区域，再进一步注释各个区域的特征。结果识别出九个成分和空间上不同的病变区域，与病理评估高度一致，且发现了新的病理区域。该结果表明Xenium技术具有识别组织学发现不了的病理变化的能力。最后将小鼠EAE的区域特征结果与人类MS样本数据联合，发现小鼠EAE和人类MS样本中某些神经胶质细胞的状态和分布是类似的。
图7
研究总结
研究利用Xenium亚细胞空间原位分析技术，选择人脑panel中266个基因对多发性硬化症的颈脊髓样本进行靶向检测，进而构建单细胞分辨率的细胞空间图谱。在数据分析部分，没有复杂的多种数据联合分析，而是仅基于Xenium数据，就可以识别患者组织切片中更多的（九个）成分和空间上不同的病变区域，进而再深入探究各个区域的细胞组成和转录特征，从更高分辨率，更深层次上，更精准地解析组织的微环境及空间异质性。
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