一、来源

High-quality genome assembly, annotation and evolutionary analysis of the mungbean (Vigna radiata) genome. November 2020.
DOI:10.22541/au.160587196.63922177/v1

单位：江苏农科院

主要结果：

• 通过Nanopore+Illumina+HiC组装苏绿基因组，组装大小473.67，contig N50=11.3Mb，scaffold N50=42.4。
• 52.8%的重复序列，LTRs占33.9%。
• 预测了33924个基因，95.7%注释率。
• 绿豆与其关系最近的小豆分化时间约11.66万年前，绿豆特有基因家族277个，其中18个正选择基因。

绿豆研究进展：

• 中绿VC1973A基因组草图
• 叶发育
• 白粉病抗性powdery mildew resistance
• 豆象抗性bruchid resistance
• 耐盐 salinity tolerance
• 基因组多样性和GWAS（GBS），种皮光泽

二、结果

测序组装

苏绿一号，测序约122.9Gb数据，深度259.5X，其中Oxford Nanopore (142.4X)。
组装先使用canu纠正reads，再用wtdbg2组装。原始组装结果用Racon对nanopore reads 进行三轮纠错，使用Pilon利用二代测序数据进行3轮纠错。组装大小473.67 Mb，359 contigs, N50 =11.32 Mb。
HiC-Pro利用唯一比对reads鉴定有效和无效互作，使用LACHESIS进行聚类、排序和定向，最后挂载11条染色体。基因组大小470.45Mb（挂载率99.32%，组装率87.8%）。

image.png image.png

a-e 代表 the distribution of FPKM, gene density, density of Copia
retrotransposable elements, density of Gypsy retrotransposable elements and GC density, respectively, with
densities calculated in 200-kb windows.
f 代表 syntenic blocks.

组装评价

三方面评估：

• 组装连续性和覆盖度。二代测序reads比对99.07%；CEGMA评估连续性449个（98.03%）核心保守基因。
• 完整性。BUSCO评估，92.43%。
• HiC聚类热图。

编码基因预测

三个来源：

• ab initio ：Genscan, Augustus (v2.4), GlimmerHMM (v3.0.4), GeneID (v1.4) and SNAP
• homology-based：GeMoMa (v1.3.1)
• unigene-based prediction ：Hisat (v2.0.4) and
  Stringtie (v1.2.3), and PASA (v2.0.2)组装，TransDecoder (v2.0) and GeneMarkST(v5.1)预测。

EVM整合，PASA优化。共预测33,924个蛋白编码基因，20,446个三种证据都有。

基因功能注释

BLAST (v2.2.31) against NR, KOG,
GO, KEGG and TrEMBL database, performed KEGG pathway。
共32,470个基因注释（95.71%）。
InterProScan（包括Prosite, PRINTS, PFAM, ProDom, Smart, TIGRFAMs, SignlP, Trans memberane等）进行motif注释，共注释2,765 motifs and 35,154 domains。

非编码RNA注释

microRNA, rRNA使用Rfam数据库；
tRNA使用tRNAscan-SE。
最后鉴定86 miRNA, 352 rRNA and 653 tRNA belonging to 23, 4 and 22 families respectively。

假基因预测

假基因序列与功能基因类似，但由于突变丢失了功能。
使用BLAT将预测蛋白序列寻找可能的同源基因序列，再用GeneWise寻找不成熟的终止密码和基因序列上的移码突变，从而获得假基因，共4320个，平均长度2237bp。

重复序列注释

使用Repbase库和从头预测的重复库（采用LTR FINDER和RepeatModeler），数据库鉴定采用PASTEClassier，合并以上两个重复库作为最终库。RepeatMasker注释。共52.83%，重复元件长度46.4 Kb - 215.1 Mb。大部分是LTR（33.92%），包括56.6% Gypsy LTRs, 39.77% Copia LTRs and 3.63% other types of LTRs。

使用MISA检测简单串联重复（SSRs），共224,409 SSRs (136,045 mono-, 56,033 di-, 28,959
tri-, 1,977 tetra-, 1,098 penta-, and 297 hexa-nucleotide repeats)。全长3,252,656 bp（~0.69%）

进化分析和分歧时间估计

从绿豆和10个近缘物种（Vigna radiata , cowpea, common bean, soybean, Vigna angularis , Lablab purpureus ,Medicago
truncatula , Lotus japonicus , Vigna subterranea and Arabidopsis thaliana）中OrthoMCL软件鉴定单拷贝直系同源基因，基于该数据集采用MUSCLE+MEGA+PHYML构树。

使用Mcmctree通过最大似然树估计分歧时间，并用化石证据矫正。

image.png image.png

全基因组复制

为研究绿豆进化，将之与其他4种双子叶植物（Vigna radiata, Arabidopsis thaliana(Arabidopsis)比较，基于两物种间或物种内的成对同源基因计算4DTv (4-fold degenerate synonymous sites of the third codons)。

Vigna radiata vs Arabidopsis thaliana有分化峰值，Vigna radiata vs common bean存在低峰。表明绿豆和拟南芥分化的时间比绿豆和普通豆（菜豆）分化更早。

image.png

LTR插入时间估计

采用突变率来估计LTR插入时间。苏绿中的LTR插入事件不是很活跃。

image.png

正选择基因

通过评估单拷贝基因的Ka/Ks来检测正选择基因。共检测到18个基因。GO富集在membrane-enclosed lumen 和cell junction。