在假期的小总结,好好努力学(ban)习(zhuan)!!!!
今天这个总结,就是来关注在测序的建库实验!
(拖了非常久的一篇总结了。。。。。)
其实建库非常重要,如果一个文库建不好的话,后续的测序结果直接gg,能够得到的有用信息大打折扣!
ps:虽然现在建库属于常规操作,而且要是想省事的话可以把样品交给公司了。但是涉及到一些比较珍贵的或者是非常规样本,咱还是得掌握这个技术,自己动手去做实验不是~
目前主流的二代测序方法有PE150,PE50等,那么如果文库的片段长度太长,会造成测序的浪费。
(举个小例子:对于PE150来说,双端能各测150bp,能测到的长度为300bp, 如果片段大小比较大,比如1kb,那么中间会有一大部分测不到,信息会被浪费。)
想一想:为啥这个的二代测序的长度不能再长一些呢?有什么局限或者是问题吗?
我们来看一下,符合上机要求的DNA文库长啥样:
illumia测序文库
我们能看到除了插入片段以外,有P5,P7,Rd1 SP,Rd2 SP Index 这些都是什么呢?
我们来接着一步步来看~
说到建库的步骤,已经有很多的大神写的非常的到位了,我们可以直接看一个流程图:
建库的基本流程
Part 1
Q:如果片段比较大,我们如何去让片段变小到合适的长度呢?
一:超声
二:限制性内切酶(需要特定的酶和位点)
三:转座酶
Part 2
Q:片段化后的DNA会变成啥样?
总共可能会有3种情况:
DNA片段化后的3种情况这种片段化后的DNA除了平末端,是需要进行末端修复的。
Q:问题来了,如何进行末端修复呢?什么方法呢?
一般是用末端修复酶:(NEB 有 end repair mix )
DNA聚合酶 I(Klenow 大片段):切除3'突出端和补平5'突出端的
Klenow Fragment Exo-保留了DNA聚合酶I的5'→3'聚合酶活性,但缺少完整的Klenow酶的5'→3'和3'→5'外切酶活性。
T4 DNA聚合酶在5´→3´方向上催化DNA的合成,需要模板和引物的存在。 此酶具有3´→5´核酸外切酶活性,比DNA聚合酶I(大肠杆菌)中的酶具有更高的活性。T4 DNA聚合酶不具有5´→3´核酸外切酶功能
看末端的情况,然后选择酶进行补齐
Q:末端补齐就该加A,用什么加?
Klenow Fragment Exo-
加A注意使用的温度!
(后续有想到啥再补充!)
欢迎各位大佬批评指正~
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