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实验复盘(四)-----建库,需要注意的!

实验复盘(四)-----建库,需要注意的!

作者: liu_ll | 来源:发表于2020-02-02 17:17 被阅读0次

    在假期的小总结,好好努力学(ban)习(zhuan)!!!!
    今天这个总结,就是来关注在测序的建库实验!
    (拖了非常久的一篇总结了。。。。。)
    其实建库非常重要,如果一个文库建不好的话,后续的测序结果直接gg,能够得到的有用信息大打折扣!

    ps:虽然现在建库属于常规操作,而且要是想省事的话可以把样品交给公司了。但是涉及到一些比较珍贵的或者是非常规样本,咱还是得掌握这个技术,自己动手去做实验不是~

      目前主流的二代测序方法有PE150,PE50等,那么如果文库的片段长度太长,会造成测序的浪费。

    (举个小例子:对于PE150来说,双端能各测150bp,能测到的长度为300bp, 如果片段大小比较大,比如1kb,那么中间会有一大部分测不到,信息会被浪费。)

      想一想:为啥这个的二代测序的长度不能再长一些呢?有什么局限或者是问题吗?

    我们来看一下,符合上机要求的DNA文库长啥样:


    illumia测序文库

    我们能看到除了插入片段以外,有P5,P7,Rd1 SP,Rd2 SP Index 这些都是什么呢?

      我们来接着一步步来看~

    说到建库的步骤,已经有很多的大神写的非常的到位了,我们可以直接看一个流程图:


    建库的基本流程

    Part 1

    Q:如果片段比较大,我们如何去让片段变小到合适的长度呢?

    一:超声
    二:限制性内切酶(需要特定的酶和位点)
    三:转座酶

    Part 2

    Q:片段化后的DNA会变成啥样?

    总共可能会有3种情况:

    DNA片段化后的3种情况

    这种片段化后的DNA除了平末端,是需要进行末端修复的。

    Q:问题来了,如何进行末端修复呢?什么方法呢?

    一般是用末端修复酶:(NEB 有 end repair mix )
      DNA聚合酶 I(Klenow 大片段):切除3'突出端和补平5'突出端的

      Klenow Fragment Exo-保留了DNA聚合酶I的5'→3'聚合酶活性,但缺少完整的Klenow酶的5'→3'和3'→5'外切酶活性。

      T4 DNA聚合酶在5´→3´方向上催化DNA的合成,需要模板和引物的存在。 此酶具有3´→5´核酸外切酶活性,比DNA聚合酶I(大肠杆菌)中的酶具有更高的活性。T4 DNA聚合酶不具有5´→3´核酸外切酶功能

    看末端的情况,然后选择酶进行补齐

    Q:末端补齐就该加A,用什么加?

       Klenow Fragment Exo-

    加A

    注意使用的温度!

    (后续有想到啥再补充!)
    欢迎各位大佬批评指正~

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