多维度深刻理解食管癌致病机制-蛋白组和磷酸化修饰蛋白组定义食管癌

Nat Commun|多维度深刻理解食管癌致病机制-蛋白组和磷酸化修饰蛋白组定义食管癌靶向治疗分子亚型

今天给大家带来一篇汕头大学医学院潮汕沿海地区高发肿瘤分子生物学广东省高校重点实验室、基础医学研究所的李恩民教授/许丽艳研究员课题组与厦门大学药学院、应激细胞生物学国家重点实验室的刘文教授课题组的研究，通过对食管癌肿瘤和邻近的非肿瘤组织进行了基于质谱的蛋白质组学和磷酸化修饰蛋白组学分析，揭示了食管癌中失调的蛋白质和磷酸化蛋白；并通过聚类研究找到了可以改善食管癌患者诊断并为预后提供潜在治疗前景的分子分型。

基于大规模高分辨率质谱分析，从蛋白质组学定义明确食管癌靶向治疗的分子亚型

摘要：

食管癌(EC)是侵袭性最强的癌症类型之一，是中国癌症相关死亡的第四大原因。尽管在过去的几年里，治疗有了很大的改善，食管癌的5年总生存率(OS)仍然在15 - 25%的范围内;病人大多受益于早期诊断。在之前对食管癌基因的基因组研究中，将基因组改变与表型联系起来，揭示了一些驱动基因，如TP53、RB1、ZNF750、NOTCH1、FAT1和NFE2L2，突变频率很高。蛋白质是基因功能的执行者，基因组的改变将主要转化为蛋白质水平的变化，蛋白质功能进一步通过翻译后修饰(PTMs)进行调节。蛋白水平和翻译后修饰(PTMs)都是细胞表型的主要决定因素。因此，蛋白质组学和磷蛋白质组学分析可能为基因组分析无法解释的肿瘤生物学提供更多的见解。以质谱(MS)为基础的大规模蛋白质组学已经为结肠癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌和肝癌患者确定了新的癌症亚型和治疗靶点，并提供了宝贵的资源，扩大了我们对这些癌症的认识。研究人员对124对食管癌肿瘤和相应的邻近非肿瘤组织进行了蛋白质组学分析。蛋白质组学分析揭示了食管癌中异常调节的蛋白质、磷酸盐和通路的目录。蛋白质组分型确定了与患者生存相关的两种亚型。构建亚型诊断和预后模型以供临床应用。此外，通过功能实验预测并验证了几种潜在的针对恶性S2亚型的药物，这可能为提高食管癌治疗效果提供新的治疗机会。

关键词：

蛋白质磷酸化:蛋白质磷酸化是最重要、研究最广泛的共价修饰之一，在各种生物学过程和通路中发挥着不可替代的作用，并可逆的决定了细胞的动力学和可塑性。上游激酶可识别并修饰特定的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基，而修饰位点能够被上游磷酸酶识别并去磷酸化，磷酸化位点也可以通过形成对接位点从而介导蛋白质-蛋白质相互作用。

质谱法(Mass Spectrometry,MS)：即用电场和磁场将运动的离子（带电荷的原子、分子或分子碎片，有分子离子、同位素离子、碎片离子、重排离子、多电荷离子、亚稳离子、负离子和离子－分子相互作用产生的离子）按它们的质荷比分离后进行检测的方法。测出离子准确质量即可确定离子的化合物组成。这是由于核素的准确质量是一多位小数，决不会有两个核素的质量是一样的，而且决不会有一种核素的质量恰好是另一核素质量的整数倍。分析这些离子可获得化合物的分子量、化学结构、裂解规律和由单分子分解形成的某些离子间存在的某种相互关系等信息。

结果：

对食管癌进行了大规模的蛋白质组学和磷酸化修饰蛋白质组学分析

124对食管癌肿瘤和邻近正常样本(队列1)被分为25组进行串联质谱标签(TMT)蛋白组学，对31对样本进行无标记磷蛋白组学。来自295名患者(队列2)的食管癌肿瘤样本用于免疫组化；蛋白组学结果显示共鉴定出14252个蛋白，定量蛋白数为6468个，磷酸化蛋白组学侠士，磷酸化位点数为73651个，磷酸化蛋白有7943个，定量磷酸化蛋白位点数为67393个（图a-d）。无监督聚类分析和分层聚类结果证明肿瘤样本能与癌旁非肿瘤样本显著分开且无批次效应(图e-f)对定量蛋白和定量磷酸化蛋白进行亚细胞定位发现，绝大部分蛋白定位于细胞核、细胞膜、细胞质基质、线粒体和胞外空间(图g)。

差异蛋白的分析与通路富集

根据蛋白组学和磷酸化修饰蛋白组学的结果进行差异分析，其中图a为差异蛋白的火山图，显著的磷酸化微店的统计数量如图c所示，对显著性差异蛋白的功能富集结果显示，细胞周期、DNA修复、免疫反应和表皮间充质转化(EMT)途径等在肿瘤中上调的蛋白中占过高比例。然而，代谢和雌激素反应相关途径在下调的蛋白中过多；磷酸化修饰蛋白组学的结果显示雌激素反应相关蛋白的下调与之前的研究一致，表明雌激素信号与食管癌之间可能存在联系。除了参与细胞周期、EMT和雌激素反应相关通路的蛋白外，磷蛋白组学数据还显示，肿瘤中剪接体中的蛋白通常高度磷酸化。至此，作者将蛋白组学的结果与之前相关的基因组学研究结果相对比，发现35个已报道的显著变化基因中的30个基因可以在蛋白组学中被检测到，所以得出结论，有些疾病发生过程中的病变可能在只在蛋白组学层面被发现，这个结论揭示了食管癌发病机制可以从多个角度进行研究。

通过蛋白组学分析将食管癌分为高危组和低危组（S1亚型、S2亚型）

补充图

研究人员将蛋白组学差异分析结果排名在前25%的蛋白进行无监督聚类分析和分层聚类分析，并确定了两个平均剪影宽度最大的主要亚型，S1和S2亚型分别包含61和63个肿瘤样本(补充数据4a和图a-b)，与S1亚型患者相比，S2亚型患者的总体生存期(OS)和无病生存(DFS)预后更差，其中S1和S2亚型的OS中位数分别为1841天和655天(log-rank P<=0.05)， S1和S2亚型的DFS中位数分别为1244天和510天(log-rank P<=0.05)(图c)。S1和S2亚型患者的临床病理特征无显著差异，S1和S2之间差异表达蛋白的热图分析显示，S2亚型表现出极端表达模式;上调蛋白的表达量非常高，下调蛋白的表达量非常低。事实上，在肿瘤和非肿瘤样本中发现的差异表达蛋白和S2和S1亚型中发现的差异表达蛋白之间存在显著的重叠(图d)。与S1亚型相比，S2亚型中有984个蛋白表达显著上调，1012个蛋白表达显著下调。其中230个蛋白的表达水平发生了1.5倍以上的变化，S2亚型中分别有137个和93个蛋白表达水平上调和下调(图e)。 S2样品中分别有1446和1415个位点显著增加和减少(图f)，这些显著改变的磷酸盐中绝大多数的fold change大于2。在后续对两种亚型的富集分析结果中，S2中上调的蛋白在mRNA加工、DNA复制、DNA修复、E2F靶点和G2/M检查点等通路中富集(图d, g和补充图4d和补充数据4f)，与非肿瘤样品相比，在肿瘤样品中上调的蛋白中也富集。这说明这些通路的活性从非肿瘤到S1亚型肿瘤再到S2亚型肿瘤逐渐增强，可能导致S2亚型的恶性表型。下调蛋白富集的肌发生相关通路也显示出类似的趋势(图3d,h和补充图4d)。值得注意的是，与非肿瘤样本相比，肿瘤样本的局灶黏附和emt相关通路富含上调的蛋白。磷酸化修饰蛋白组学中差异富集结果主要在剪切体和有丝分裂信号通路富集，与肿瘤组织富集的信号通路结果一致，意味着这些通路的磷酸化对于食管癌发生过程中有重要的作用(图h)。

发现食管癌中由ELOA和SCAF4组成的亚型诊断特征

接下来研究人员为了进一步确定食管癌亚型的诊断模型，分别使用最大值进行特征设置为1、2、3或4的特征数量，以ROC曲线下面积AUC作为标准，共识别出11个独特的模型（图a），其中模型“ELOA, SCAF4”频率最高，500个交叉验证实验证明了“ELOA, SCAF4”具有良好的预测性能(平均AUC = 0.970)(图b)。为了进一步验证模型的效果是否可靠，研究人员进行了免疫组化实验验证，结果显示，“ELOA, SCAF4”在S2亚型中的免疫组化染色效果明显高于S1亚型(图e-f)，Kaplan-Meier曲线和log-rank检验显示S2亚型的总体生存期(OS)和无病生存(DFS)都比S1亚型短，进一步说明了模型的准确性。

S2亚型治疗药物的预测和验证

为了寻找食管癌患者的治疗策略，研究人员选择了在肿瘤和非肿瘤样本之间差异表达的蛋白用于药物预测，并与Connectivity Map数据库中的结果进行比对，筛选到五种药物。同时，对于更加恶行的S2亚型，研究人员将S1和S2亚型中都有差异变化并显示不良预后的蛋白与Connectivity Map数据库对比，从映射的药物中选择负连通性得分最高的6种候选药物。后续实验验证过程中，发现这六种药物都发挥了抑制肿瘤组织增殖的作用(图d-h)。

药物对两种亚型中差异表达蛋白的调控作用机制

实验过程中GW8510、Menadione和Sulconazole这三种药物效果作用尤为有效，所以进一步研究三种药物调控作用机制，在KYSE150细胞中，S1和S2亚型对这三种药物反应的蛋白表达存在显著差异，说明了这三种药物对S1和S2亚型中差异表达的绝大多数蛋白质都表现出了显著的影响。

文章小结：

到这里文章就结束啦，整体看文章主要创新点在于将肿瘤的分子分型通过磷酸化修饰蛋白组、蛋白质组等组学技术，对食管癌进行分子谱的系统描绘，并根据分子特征谱，进行肿瘤的精准亚型分类及针对亚型的精准治疗。肿瘤分子分型目前作为国家精准医疗战略的重点研究投入方向，目前也备受顶刊杂志青睐。

更多精彩文章尽在生信人公众号