一文阐述链特异性测序——stranded? reverse-st

小小的眼睛里，装着……大大的疑惑

全文2800字，伤脑筋……

今天尝试把自己对于 stranded、reverse-stranded、un-stranded 这个问题的理解给讲清楚，有不对的地方还请大家批评指正，相互交流学习~

其实这个问题的是伴随着链特异性测序的兴起而产生的，那么为什么要有链特异性测序呢？

一些链

我们都知道DNA有两条链，很自然的我们就想把这两条链给区分一下，所有就有了各种链的定义：

• 正负链
  正负链这个定义实际上很“人为”，在参考基因组中，DNA的一条链被指定为正链，另一条链就被指定为负链，这个指定是大家都保持一致的，即通用，我们所使用的参考基因组都是正链的序列。在文献中往往被翻译为：正链（forward strand; plus strand）与负链（reverse strand; minus strand）。

• 模板链、非模板链
  在转录过程当中，与RNA结合，充当转录模板的那条DNA链，我们称之为模板链，自然另外那条链就称为非模板链。简单来说，模板链是与RNA互补的那条DNA链，非模板链是与RNA序列相同的那条链（这样说不严谨，但是方便大家理解）。

• 正义链、反义链
  接着前面的，正义链就是和RNA序列相同的那条DNA链，反义链就是和RNA互补的那条DNA链。在文献中往往被翻译为：正义链（sense strand）和反义链（antisense strand）。

• 编码链、非编码链
  接着前面的，编码链就是和RNA序列相同的那条DNA链，非编码链就是和RNA互补的那条DNA链。在文献中往往被翻译为：编码链（coding strand）和非编码链（noncoding strand）。

难以理解……上图：

总结起来：
非模板链 = 编码链（coding strand）= 正义链（sense strand)
模板链 = 非编码链（noncoding strand） = 反义链（antisense strand）

链特异性测序

为什么要有链特异性测序？答案就是：

"With non-stranded RNA-Seq, you can't tell whether a sequencing read represents the plus or minus strand of the DNA template. In comparison, stranded RNA-Seq distinguishes the first and second strands of cDNA."

总结来说，链特异性测序有这几个优点是链非特异性测序所不具备的：

• Identify antisense transcripts
• Annotate a genome
• Discover novel transcripts

设想分别位于正负链上的两个基因有一个共同的区域（overlap gene），那么如果我们用链非特异性测序：

non-stranded RNA-seq

详细讲一下该图的建库流程：
（1）oligo-dT富集：我们一般说的RNA-seq是指mRNA，但是我们提出来的总RNA有接近90%全部是rRNA，我们只想得到mRNA，利用真核生物mRNA一般都带有polyA的尾巴这一性质我们设计oligo-dT去与这个polyA的尾巴进行杂交，就能把我们想要的mRNA给富集出来。

• 为什么只有mRNA被加尾？
  在真核生物中，mRNA由RNA聚合酶II转录，而rRNA大部分由RNA聚合酶I转录，加尾需要一系列加尾因子的作用，而这些加尾因子只有RNA聚合酶II才能够对它们进行招募富集。

（2）添加随机引物进行链的合成：这个过程实际上就是一个DNA双链的合成，无论你起始的mRNA是上面的哪一条，最终形成的两条DNA双链基本是一样的（考虑到随机引物的结合位置，两个DNA分子会有差异）。

（3）添加接头：我们最终会使用illumina进行测序，从这一步开始实际上已经开始构建测序文库了，这里添加的是“Y”接头，注意，这个接头并不是互补配对的，从图里就可以看出，是“Y”字形，显然不是互补配对的。但是你会发现，紫色的接头是都位于5'端的，而红色的接头则都是位于3'端的。

（4）PCR扩增：这一步扩增的引物结合位点是在前面的接头中的，而不像前面的随机引物了。可以看到，左右两边都扩增产生了两个DNA分子，我们通过添加read1的测序引物就能测得read1，同理，添加read2的测序引物就能测得read2。但是在这里你就会发现一个尴尬的问题，无论是左边还是右边，read1测出来的序列并不一样，拿左边举例，上面那个DNA分子测出的序列为浅灰色的序列，即Plus Stranded mRNA的互补链，而下面的DNA分子测出来的序列为深灰色的序列，即和Plus Stranded mRNA序列一样的那条链。这样在同一个库中，你最后得到的read1你也不知道它到底和mRNA之间的关系是怎样的，所以就是链非特异性了。

但是当我们换成链特异性测序：

stranded RNA-Seq

以Plus Stranded mRNA举例：首先还是以mRNA为模板进行第一链的合成，然后在利用RNaseH对杂合链中的RNA进行降解，再利用含有dUTP的反应液进行第二链的合成，添加接头。来看它是如何实现链特异性的：

（1）第一种方法是，我使用能够特异性降解含有尿嘧啶（U）的酶来对含有U的链进行降解，然后再进行链的合成，这样，我的文库里面显然只会有一种DNA分子，我测出来的read1自然就肯定是mRNA的序列（在这张图里）。
（2）第二种方法是，将含有U的DNA双链解开，进行扩增，但是DNA聚合酶没有办法以U为模板进行扩增，所以最终所有的DNA分子也只有一种，就是DNA聚合酶以没有U的DNA单链为模板合成的DNA分子，这个时候测出来的read1显然也只能是mRNA的序列。

通过上面的方法，你就能知道你的read1到底是测的哪条链，就实现了真正的链特异性测序了。

stranded 与 reverse-stranded

这个问题实际上来源于我在使用featureCounts进行定量时的一个选项，下面是这个选项的描述：

很难搞清楚……这里的0、1、2是什么意思。实际上不仅仅是 featureCounts ，还有很多工具都有这个类似的选项，比如：TopHat、HTSeq、RSEM、Salmon 等等。下面借用一张网图来对这个问题进行解释：

我们在进行双端测序的时候，会有read1与read2，但是就会有三种情况，第一种是read1就是测到的sense strand的信息（condition A），第二种情况是read1测到的是antisense strand的信息（condition B），第三种情况就是前面讲到的链非特异性测序（condition C）。那我们要对这个进行区分，就需要指定上面的这个参数，例如 featureCounts 中，-s 0就表示链非特异性测序，也就是 condition C；-s 1就表示，read1测到的是sense strand的信息，也就是 condition A，也就是它自己所描述的 stranded；-s 2就表示，read1得到的是antisense strand的信息，也就是 condition B，也就是它自己所描述的 reversely stranded 。

好了，上面的清楚了，但是同样是这样的一个问题，不同的软件……它有着不同的描述，例如 TopHat 就不是用 stranded 和 reversely stranded 来定义（这也是我认为最好相通的），它用 first stranded 和 second stranded 来定义这件事，它的 first stranded 表示 read1测到的是antisense strand的信息！，second stranded 表示 read1测到的是sense strand的信息！这在我看来……是很奇葩的，是很容易搞混淆的。

下面用一张图进行一个汇总，实名感谢这篇帖子Strandness in RNASeq，应该是全网讲的最清楚的了：

注：这里的 caseA 就是上面的 condition A，以此类推

fr & ff & rf & f & r

细心的人会注意到上面的 TopHat 参数中有个 fr，这又是什么……？

先上图（图片来源：https://www.biostars.org/p/344264/）：

• 单端测序
  对于单端测序来说，f 就表示这个read1测出的信息是从5'端开始的，而 r 则表示read1测出的信息是从中间开始的，显然现在基本上已经全都是 f 模式了。注意，在两种不同的模式下，first stranded 含义又不同了！
• 双端测序
  在双端测序下，如果read1与read2是头对头的，就称之为 fr ，如果是都位于一条链上，则称之为 ff ，如果是尾巴对尾巴的，则称之为 rf 。注意，在三种不同的模式下，first stranded 含义又不同了！

来个生动的例子，大多数情况下，单端测序测出来的reads一般就是sense strand的信息，但是我就遇到过测出来的反而是antisense strand的信息的情况，这是一个PRO-seq的单端测序数据，首先在igv上看一下：

igv
你可以看到，最上面的那套数据，所有的reads全部是比对到反链上的，但是在这个区间里面只有正链基因PTBP2，所以如果不把这个问题搞清楚……后面的分析基本要出问题。

建库决定read1的信息

上面那张表，不同的建库方式就会有不同的结果，总结一下：

• read1的信息是sense strand的：Ligation & Standard SOLiD
• read1的信息是antisense strand的：dUTP & illuminaTruSeq Stranded
• 链非特异性测序：Standard illumina

下面尝试理解为什么 dUTP 建库为 reversely stranded ，而 Ligation 建库为 stranded 。针对这个问题的理解，最多的就是这个图了：

但是这个图分不清sense和antisense，可以看我的这张：
dUTP vs Ligation
详细来讲：
在这里，红色始终表示sense strand的信息，天蓝色始终表示antisense strand的信息，蓝色和黄色表示接头，深绿色和玫瑰红色表示reads。
需要注意的是：在将adapter连接到待测序的核酸链上时，能够与裸露的3'端连接的一定是黄色的adapter；而能够与裸露的5'端连接的一定是蓝色的adapter！而我们在测序时，首先会添加能够与蓝色adapter结合的测序引物进行测序，生成read1，随后才是生成read2。仔细看就知道，从连上接头两边就已经开始出现差异了，所以这两种测序建库方法，得到的reads与链之间的关系一定是相反的~

怎么办？

• 遇到这个问题，首先是去看测序数据的建库方式，这样就能判断了；

• 如果建库信息没有，先进行比对，无论怎样建库，比对这一步不会有这些信息的干扰，比对出来后，利用bam文件在igv上进行判断，你就能知道read1到底是sense strand的信息还是antisense strand的信息了。

今天又是摸鱼的一天！