文章链接为：《Computational prediction and experimental
validation identify functionally conserved
lncRNAs from zebrafish to human》

Github：https://github.com/huangwenze/lncHOME_analysis/tree/main

1. 从转录本数据鉴定出lncRNA的注释

对于小鼠和人的数据， human：(GENCODE v25) 和 mouse：(GENCODE vM10)。剩下的6个脊椎动物 cow, opossum, chicken, lizard, frog and zebrafish 则是在NCBI上下载转录组序列，进行转录本组装，鉴定lncRNA，鉴定的步骤为：

1. 利用 FastQC 生成质量报告。
2. 利用 Trimmomatic 过滤低质量的reads
3. 利用STAR 的 TwoPass Mode （参数为 --sjdbFileChrStartEnd）将reads进行mapping并生成 bam 文件
4. 利用 StringTie 进行转录本组装，用 Cufflink 进行注释文件的 merge
5. 选择 length (≥200 nt), expression level (FPKM > 0.5) and protein-coding potential (CPAT v3.0.0 (ref. 32), CPAT score >0.5)length (≥200 nt), expression level (FPKM > 0.5) and protein-coding potential (CPAT v3.0.0, CPAT score >0.5) 的基因定义为 lncRNA

最后，作者从Ensembl, NCBI, NONCODE, DeepBase and the Ulitsky laboratory 这几个数据库中下载对应物种的lncRNA注释，然后和上面鉴定出来的lncRNA注释merge到一起，组成 final lncRNA 的注释

2. 选择序列相似性高的lncRNA序列对

对于两个序列的protein-coding 和 lncRNA 序列，作者利用序列相似性来初步判断它们是否同源（BLAST v2.12.0 bl2seq ，E value < 10−4, hit length >50 nt，overall sequence identity >50%)

并且定义两个物种基因数量保守的相似性为：

其中：x 为物种 1 中 protein-coding （或者 lncRNA）genes的数量；y为物种 2 中 protein-coding （或者 lncRNA）genes的数量；n 代表两个物种共有的 protein-coding （或者 lncRNA）genes的数量

3. 由protein-coding gene 的同源性预测 lncRNA基因的同源性

作者从 OrthoDB 中下载对应物种的protein-coding gene的信息，并且以某个基因为原点，向上下游各拓展到 1Mbp，在这 1Mbp 的范围内（不包括基因）利用双序列比对的方法寻找 Genomic anchors

这个 Genomic anchors 的计算方式是通过ucsc的chain file来实现的，具体两个物种或者两个版本的基因组的chain file的解释参见：https://www.zxzyl.com/archives/838/

个人感觉

Genomic anchors代表的是ungapped的区域

如何生成 chain 文件？可以参考：

1. 使用liftover创建注释Chain文件（基因组坐标转换）
2. 使用transanno制作不同基因组版本坐标映射的chain 文件？

理解 Genomic anchors 后，作者在某基因1Mbp的范围内划分upstream和downstream

如上图所示：

1. 设 mu1 代表物种1在upstream区域内对应点的个数
2. 设 mu2 代表物种2在upstream区域内对应点的个数
3. 设 mu 代表物种2在upstream区域内Genomic anchors的个数（连线的点）
4. 设 md1 代表物种1在downstream区域内对应点的个数
5. 设 md2 代表物种2在downstream区域内对应点的个数
6. 设 md 代表物种2在downstream区域内Genomic anchors的个数（连线的点）
7. 设 mf1 代表物种1在upstream+downstream区域内对应点的个数
8. 设 mf2 代表物种2在upstream+downstream区域内对应点的个数
9. 设 mf 代表物种2在upstream+downstream区域内Genomic anchors的个数（连线的点）

对于upstream和downstream的区域如上图b所示，定义proportion score mu为：

proportion score mu 和 proportion score mf 的定义类似
因此，作者利用 OrthoDB protein-coding的同源基因，按照上述图b方法，计算mu1，mu2，md1，md2，mf1，mf2，proportion score mu，proportion score md，proportion score mf 这几个特征。
正负样本区分如下：

利用随机森林训练模型，然后用鉴定出来的lncRNA去进行预测，判断lncRNA基因对是否同源