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易基因|ENCODE组蛋白ChIP-seq和转录因子ChIP-s

易基因|ENCODE组蛋白ChIP-seq和转录因子ChIP-s

作者: 表观遗传学爱好者 | 来源:发表于2022-07-15 10:37 被阅读0次

    ENCODE (Encyclopedia of DNA Elements) 作为DNA调控元件百科全书整合了1w+个来自不同组织或细胞系的各类实验数据标准。以表观组学研究中的ChIP-seq为例,ENCODE Consortium使用不同的表观基因组分析,并制定对应的分析方案和指南,具有绝对的权威和参考意义。

    本期,说明ENCODE数据库的组蛋白ChIP-seq和转录因子ChIP-seq指标要求,包括测序分析概述、处理流程(Pipeline)指南和不同分析类型的数据标准。

    组蛋白 ChIP-seq 数据标准和处理流程

    (1)分析概述

    ChIP-seq是一种用于分析蛋白质与DNA互作的方法。ChIP-seq将染色质免疫沉淀与DNA高通量测序相结合,以推断DNA相关蛋白的可能结合位点。ENCODE Consortium开发了两个分析pipeline来研究两种不同类别的蛋白质-染色质互作(组蛋白ChIP-seq和转录因子ChIP-seq)。组蛋白ChIP-seq的pipeline适用于与较长区域或结构域上的DNA相关蛋白质。典型的靶点是组蛋白或特定的翻译后组蛋白修饰。

    (2)处理流程

    组蛋白ChIP-seq和转录因子ChIP-seq的流程具有相同的比对步骤,但在信号和peak calling方法以及随后的重复样本统计处理方面有所不同。

    组蛋白分析流程可以解析点状结合和更长的染色质结构域,这些结构域由许多靶蛋白或靶修饰实例结合。组蛋白ChIP-seq 流程的output适合作为将染色质区域分类为功能类别的染色质分割模型的input。

    图1:具有生物学重复实验的组蛋白ChIP-seq分析流程 图2:没有生物学重复实验的组蛋白ChIP-seq分析流程 表1:组蛋白ChIP-seq分析流程的inputs        表2:组蛋白ChIP-seq分析流程的outputs

    (3)流程指南

    读长应至少为50个碱基对,鼓励更长的读长;分析流程可以处理低至25个碱基对的读长。可以配对或单端测序。

    应注明使用的测序平台。不同的测序平台可能没有可比性。如HiSeq2000与HiSeq4000的重复不同,没有可比性。

    生物学重复应在读长和运行类型方面相匹配。

    Pipeline文件比对到人(GRCh38)和鼠(mm10)序列。

    (4)现行标准

    验应该有两个或多个生物学重复。由于实验材料的可用性有限,使用EN-TEx样品进行分析可以例外。

    抗体必须根据ENCODE Consortium制定的标准进行鉴定。

    每个ChIP-seq实验应该有相应的input控制实验,具有匹配的运行类型,读长和重复结构。

    使用非冗余分数(NRF)和PCR瓶颈系数1和2,PBC1和PBC2衡量文库复杂性。优选值如下:NRF>0.9,PBC1>0.9,PBC2>10。

    特定目标标准

    narrow-peak组蛋白实验,每个重复应该有不低于20M可用片段。

    broad-peak组蛋白实验,每个重复应该有不低于45M可用片段。

    H3K9me3是一个例外,因为它在基因组重复区域富集。与其他broad Marks相比,在组织和原代细胞中基因组的非重复区域中几乎没有H3K9me3 peaks。导致许多ChIP-seq reads比对到基因组中的非唯一位置。组织和原代细胞每个重复应该有不低于45M总比对 reads。

    图3:特定目标标准

    转录因子ChIP-seq 数据标准和处理流程

    (1)分析概述

    转录因子ChIP-seq (TF ChIP-seq) 处理流程适用于预测以点状方式结合的蛋白质,例如特定 DNA 序列或特定染色质结构。其中,IP标靶通常是已知或推定的转录因子或染色质重塑蛋白,也可以是 RNA 结合蛋白、其他 DNA 或染色质特异性因子。

    (2)处理流程

    组蛋白ChIP-seq和转录因子ChIP-seq的流程具有相同的比对步骤,但在信号和peak calling方法以及随后的重复统计处理方面有所不同。转录因子ChIP-seq(TF ChIP-seq)专门研究被认为与特定DNA序列相关联以影响转录速率的蛋白质。

    图4:具有生物学重复实验的转录因子ChIP-seq分析流程 图5:没有生物学重复实验的转录因子ChIP-seq分析流程 表3:转录因子ChIP-seq分析流程的inputs        表4:转录因子ChIP-seq分析流程的outputs

    (3)流程指南

    读长应至少为50个碱基对,鼓励更长的读长;分析流程可以处理低至25个碱基对的读长。可以配对或单端测序。

    应注明使用的测序平台。不同的测序平台可能没有可比性。如HiSeq2000与HiSeq4000的重复不同,没有可比性。

    重复应在读长和运行类型方面相匹配。

    Pipeline文件比对到人(GRCh38)和鼠(mm10)序列。

    (4)现行标准

    实验应该有两个或多个生物学重复。由于实验材料的可用性有限,使用EN-TEx样品进行分析可以例外。

    抗体必须根据ENCODE Consortium制定的标准进行鉴定。

    每个ChIP-seq实验应该有相应的input控制实验,具有匹配的运行类型,读长和重复结构。

    使用非冗余分数(NRF)和PCR瓶颈系数1和2,PBC1和PBC2衡量文库复杂性。优选值如下:NRF>0.9,PBC1>0.9,PBC2>10。

    特定目标标准

    每个重复应该有不低于20M可用片段。

    低reads深度:10M到20M可用片段

    reads深度不足:5M到10M可用片段

    极低的reads深度:< 5M可用片段

    对于转录因子ChIP-seq实验,通过计算IDR值(Irreproducibility

        Discovery Rate)来检测生物学重复之间的重复性。如果rescue和self consistency ratio均小于2,则实验成功。

    其他指标

    在没有定义阈值的情况下计算额外的指标,例如FRiP(fraction of reads in peaks),在比较类似实验时很有用。

    以上为ENCODE数据库中组蛋白ChIP-seq和转录因子ChIP-seq数据标准及处理流程是简要说明。

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