关键词

蛋白模拟材料，多价分子识别，构象展示，二维纳米材料，生物启发的聚合物

文献信息

"Discovery of Stable and Selective Antibody Mimetics from Combinatorial Libraries of Polyvalent, Loop-Functionalized Peptoid Nanosheets"

ACS Nano 2020, 14, 185−195

DOI: 10.1021/acsnano.9b07498

摘要

抗体可以结合多种多样具有高特异性和高亲和力的分析物，使其成为理想的分析物靶蛋白背景治疗和诊断应用的候选。然而，抗体的稳定性差、生产成本高，需要探索多种具有特定分子识别能力的合成材料。不幸的是，创造化学多样性的类蛋白质群体，具有明确分子构象的折叠纳米结构仍具有挑战性。本文报道了合成和筛选序列明确的类肽聚合物组合文库组合，并可以折叠成有序的超分子纳米片循环，类肽纳米片呈现出高度的空间密度，多样性，构象性它们表面上有限制性的类肽环。这些多价环功能化纳米片使用同质Förster共振能量转移(FRET)试验进行筛选，用于与各种蛋白质靶标结合。经鉴定，与炭疽保护性抗原七聚体蛋白结合的肽样序列具有较高的亲和性和选择性。这些纳米片被证明对蛋白质水解降解具有抗性，并且结合被证明依赖于环显示密度。这项工作表明，抗体结构和功能的关键方面——在定义良好的折叠结构中创造多价组合化学多样性——可以用完全合成的材料来实现。这种方法能够快速发现将合成材料的耐久性与生物分子材料的特异性相结合的仿生亲和试剂。

摘要图

研究背景

图1

结果与讨论

1.环类肽文库的设计

抗体的不同抗原特异性是通过互补决定区(CDR)结构背景下的化学多样性(即20种氨基酸的组合)实现的。为了复制抗体与相应抗原的结合特异性，环功能化纳米片是一种理想的支架，因为有机会在从纳米片极性表面投射出的构象约束环域内显示化学上不同的部分。对于这些显示的环，我们鉴定出一组7-亲水(P)和13-疏水(H)类肽单体，具有与天然氨基酸相似的独特化学性质(图2a)。组合环库设计为包含特定的H和P单体组合，以避免环域内的极端疏水性或电荷。这些组合是根据基于单体化学性质、多肽合成的可行性及其折叠成纳米片的能力的设计规则选择的(图2b)。我们将环结构域的长度固定为6个单体，以便从纳米片表面突出足够远，以便有效地结合蛋白质长度为6个单体的类肽环预期具有构象刚性，这已在大小相似的类肽大环中显示出来。有64个仅考虑单体的H和P性质，分析了6-聚合物环序列的两亲性HP谱。我们之前的研究确定了纳米片的形成机制涉及一个关键的中间体，其中肽必须吸附到空气-水界面以形成有序的单层。因此，必须平衡整体的水溶性和表面活性，以促进纳米片表面的自组装和正确的环折叠。因此，我们排除了H和P单体交替出现的序列，23个H单体的序列，以及22个大H单体的序列。利用这些规则，我们随机选择了12个六聚体HP模式。将化学多样性引入到环路序列中，根据每个单体的一级和二级化学特征:芳香族，小脂肪族，大脂肪族，大疏水，阳离子，阴离子，氢键供体/受体，杂环。考虑到这些单体的化学特性，将12个初始HP模式枚举为256个特定序列，以尽量减少同一序列中不同单体的数量。通过这种方式，可以最大限度地提高每个环的化学清晰度，从而更容易地识别分子识别所必需的关键化学性质 (表S1)。

图2.

2.筛选环类肽文库和结合验证

发现纳米片亲和试剂的第一个障碍是有效地将单个肽样链库转化为环功能化的纳米片库。一般来说，这种超分子组装过程是通过在空气/水或油水界面形成肽样单分子层的横向压缩来完成的。旋转玻璃瓶的装置将含有毫升体积的类肽溶解液从垂直到水平设计，以诱导3倍的界面面积变化，以获得高质量的类肽纳米片。但摇瓶法在高通量文库生成和筛选中难以并行化，且操作规模为毫升，造成不必要的材料浪费，随着文库规模的增加，材料成本过高。为了应对这一挑战，我们建立了一种有效的移液方法用自动移液机器人，制备可在多孔板中执行的纳米片。通过移液抽出水溶液，在移液器尖端内形成空气/水界面。由于尖端的锥形几何形状，界面面积取决于吸入液体的体积 (图S1)。通过重复抽吸和分配循环，可以在更小的体积尺度(~10 μL)实现与摇瓶法相当的表面压缩 (图3a)。移液法合成的纳米片质量(尺寸、厚度和均匀性)与摇瓶法制备的纳米片一致(图3b，图S2)。移液法的吸引人之处在于它很容易自动化的，可以在多孔板格式中进行，并生产适合直接用于后续蛋白质结合筛选的浓度和缓冲的纳米片。

图3

为了评估每个环显示的纳米片的蛋白质结合能力，我们开发了一种基于之前开发的均质FRET结合分析的筛选方法，将纳米片与十八烷基罗丹明(OR)混合，将其脂肪族尾巴固定在薄片的疏水核心中，并作为FRET供体。这些OR标记的薄片在与Alexa Fluor 647 (AF647)偶联靶蛋白结合在纳米薄片表面时产生FRET信号 (图S3)。通过分析对照(无环)、生物素化和球三基化纳米片在蛋白质不存在和存在情况下的荧光光谱，通过纳米片与相应靶标的结合事件产生正FRET信号(图S4)。通过共聚焦显微镜对球三基化纳米片表面进行光谱扫描，证实FRET信号源于蛋白质与纳米片表面的结合 (图S5)。为了估计结合程度以选择hits，基于曲线拟合计算FRET比值，以防止荧光光谱中噪声引起的潜在误差。我们发现，这种方法可以令人满意地识别与传统FRET比率测量相似的高FRET命中(~ IAcceptor/IDonor) (图S6)。在志贺毒素1亚基B (STX 1B)存在的情况下，对每个无环、生物素化和球状三酰化纳米片的10个样品进行拟合校正比分析(图S7)，显示z因子约为0.73，表明该方法足以进行高通量筛选。

接下来，我们应用我们的自动化筛选平台来发现能够选择性结合炭疽保护抗原(PA63)的环功能化纳米片，这是一种同七聚类毒素相关蛋白。为了测定结合特异性，我们获得了每个环形纳米片相对于荧光标记(PA63)、其他多聚体对照蛋白、STX 1B和链霉菌亲和素的FRET值，并计算了结合特异性的比值评分。通过平行筛选60个变体的纳米片库，发现样品L034纳米片具有最高的特异性评分(PA63) (图3c)。

在成功鉴定(PA63)的命中位点后，我们使用小瓶摇摆法将几个候选纳米片的制备扩大到毫升级，以允许更严格的结合亲和力验证和表征。这种从微观筛选到宏观生产的无缝过渡突出了该平台在快速亲和试剂开发方面的实用性。放大后，我们通过FRET试验和荧光显微镜检查了(PA63)的一致性、与L034纳米片的结合特异性。作为阳性对照，我们创建了一个纳米片，显示一个包含已知(PA63)的环，由肽六聚体TYWWLD组成的结合基序，先前通过噬菌体展示方法发现(图3d)。荧光显微镜图像和FRET实验表明，只有 (PA63) 被LO34纳米片选择性捕获，并被TYWWLD纳米片特异性结合(图3e，图S8，S9)。这一结果证明了从组合文库的微观筛选中快速发现抗体模拟物的能力，并立即将命中量扩大到毫克规模，以进行进一步的测试和使用。

3.结合特异性：环功能化纳米片的化学性质和多价

(PA63)绑定命中，LO34，有一个循环插入序列 Namd-Ntyr-Ntyr-Ntyr-Ntyr-Namd，由两个小的组成极性羧酰胺甲基(Namd)侧链和四个芳香羟基苯乙基(Ntyr)侧链(图3d)。有趣的是，这与阳性控制环(TYWWLD)属于相同的HP家族，其中有四个中心疏水性基团，两侧是两个极性基团(即PHHHHP)。此外，两者在疏水环区域都含有三个芳香族残基，允许我们考虑环的特定化学特征对(PA63)识别的影响(表S2)。鉴于在我们的命中序列和阳性对照序列中疏水侧链的优势，我们首先研究了其他疏水文库成员的结合。还有另外5个具有相同PHHHHP图案的环功能化纳米片没有被识别(PA63)，(图S10)表明芳香丰富度是(PA63)识别的主要因素。我们还从已知的TYWWLD肽序列中设计了一个全类肽类似物 (合理设计的类肽，Rtoid)，探索了环域中多个芳香族衍生物的重要性，该肽序列具有三个芳香族基团(图S11)。Rtoid纳米片表现出较强的结合能力，表明芳香侧链在结合中起主导作用。在这些观察的激励下，我们绘制了(PA63)，特异性结合能力与环区芳香族单体数量的关系(图4a)，结果显示23个芳香族单体是必要的，但不足以结合。第二种化学性质，即氢键供体，也是结合所必需的。附加的二级性质如氢键受体或手性是不需要的。

含有芳香族和氢键供体属性的环的特定结合亲和力提示它们与(PA63)的特定位点相互作用。通过对L034或TYWWLD纳米片进行竞争结合实验 (图4b)， 78 μM LO34纳米片的一半最大抑制浓度(ICso)值与98 μM TYWWLD纳米片的一半最大抑制浓度(ICso)值相似，表明它们与(PA63)%的相同结合位点相互作用。TYWWLD肽环构象与(PA63)结合的计算对接模拟，提供了有关分子相互作用的见解。YWW中心残基与P184、F202、F203、S204和P205密切接触 (≤4.5 A)，已知这些残基在(PA63)中形成疏水结合袋苯丙氨酸通过π-π相互作用促进与芳香族肽残基的相互作用。此外，已知脯氨酸优先与富电子芳烃(如酪氨酸和色氨酸)通过CH-z相互作用，而与低电子芳烃和非芳烃相反综上所述，我们设想由许多富电子芳香官能团组成的环域可以通过π-π和CH-π相互作用识别(PA63)的疏水口袋。

从多价结合的角度来看，肽样纳米片表面结合环的空间排列对其特异性起着关键作用。环在链方向上的距离约为5.1 nm，接近于(PA63)结合位点之间的第二短距离5.4 nm，如图L034纳米片的模拟结构所示 (图4c)。由模型可知，(PA63)的疏水结合袋覆盖在板材表面的多个环上，表明可能同时发生多个结合事件，即多价结合。通常，多价性会导致非线性的结合响应如超选择性和高结合亲和力我们探索了环显示密度对(PA63)的影响，通过用不同数量的无环纳米片形成肽样物稀释 TYWWLD 和 L034 环链来结合。这就产生了一系列具有不同环间间距的共组装纳米片。结合度随环间距呈非线性响应 (图4d)。两种纳米片的阈值距离为~3.8 nm，接近 (PA63) 结合位点之间的最短距离。这表明闭环间距是协同结合和高亲和力所必需的。环与 (PA63) 之间的多价相互作用也得到了透射电镜直接观察的支持，透射电镜显示(PA63)的中心孔垂直排列在TYWWLD和L034纳米片的表面(图4e)。

图4.

4.环功能化纳米片的结合性能：结合亲和性和蛋白水解稳定性

为了评估我们鉴定的亲和试剂在实际应用中的可行性，我们根据我们以前开发的方法，使用生物分子层干涉测量法(BLI)评估了它们的结合性能我们通过Langmuir-Schaefer沉积将环功能化的肽样单分子层转移到光纤的疏水表面，暴露出可以捕获目标蛋白质的环域。BLI允许基于白光从功能表面反射形成的干涉模式对结合蛋白进行实时、无标签监测，允许测量结合亲和力。L034和TYWWLD单分子层立即捕获并紧密固定(PA63)，在其表面按照关联和解离阶段。相比之下，无环肽样单分子层没有结合反应(图5a)。分析L034和TYWWLD的结合曲线发现，这些环功能化单分子层具有个位数的纳摩尔结合亲和力，分别为2.0 nM和1.6 nM(表S3)，与重组抗体和自然互补成分(即水肿因子和致死因子)的Ko相当。与已知的单价TYWWLD配体的微摩尔结合相比，这些材料的结合亲和力非常高总之，这些结果表明，由于设计和工程的多聚体结构的高亲和性，结合亲和力显著增强。

除了它们出色的结合性能外，由于类肽对蛋白酶的化学稳定性和持久性，这些材料有望作为强大的亲和试剂支架。为了证明这一点，我们用原子力显微镜监测了L034纳米片的蛋白质水解稳定性。在蛋白酶处理后，全肽L034纳米片保持环路结构，含有肽的 TYWWLD 纳米片最初粗糙的表面变得光滑 (图5b)。此外，L034纳米片的厚度没有变化，而 TYWWLD 纳米片的厚度从蛋白酶处理后4.7 ~ 3.4 nm (图5c)。这些结果表明，虽然 TYWWLD 纳米片的肽环通过蛋白水解降解被消除，但全肽类LO34纳米片具有较高的蛋白水解抗性。我们使用多色荧光成像技术进一步研究了蛋白水解降解对L034和TYWWLD纳米片结合活性的影响，纳米片使用德州红(TR)滤光片，(PA63)使用CyS滤光片，蛋白质分别为黄色和红色 (图5d)。TYWWLD纳米片与(PA63)孵育后呈橙色，经蛋白酶处理后变为黄色，表明脱除TYWWLD环导致对(PA63)的结合亲和力丧失，然而，在蛋白酶孵育后，LO34纳米片在合并荧光图像中保持橙色，表明它们保留了(PA63)的结合活性。我们用FRET实验证实了这些结果，其中TYWWLD环的蛋白降解也显示了(PA63)的丢失，与L034纳米片的FRET信号的可忽略不计的变化形成对比 (图5e)。这些类肽结构抗蛋白水解的持久性突出了这种合成系统的主要优势。

图5.

结论

我们描述了一种使用纯合成方法生成具有特定蛋白质结合的2D抗体模拟材料的方法。该方法采用高通量筛选技术。非天然，序列定确定的肽类肽聚合物折叠成蛋白质样结构的组合文库。L034纳米片与(PA63)的选择性结合亲和力灵敏度取决于表面显示的环的化学特性。此外，表面环的空间密集显示使高结合亲和性，通过多价相互作用显著提高与目标蛋白的结合亲和性。这些非天然纳米片的主要优势是，它们相对于抗体具有巨大的结合表面积，并使它们特别适合与大型多价靶标接合。此外，通过AFM、荧光成像和FRET结合试验的详细分析表明，它们的非天然类肽化学性质使它们对蛋白水解攻击具有鲁棒性。鲁棒性是使用非天然主干化学的一个有价值的特性，允许在不严格纯化的生物流体中进行筛选，并发现在更苛刻和更实际的使用情况下操作的亲和试剂。这项工作在抗体模拟材料的几个关键方面取得了进展，展示了一种合理和可扩展的策略，用于生成和筛选大型化学文库，通过多价性生成具有高选择性结合亲和力的材料，以及通过不涉及动物的简单批量合成方法立即扩大命中产量的能力。筛选能力仅受到用于混合和测试组合库成员的流体方法的限制。使用现有的微流控小型化方法，筛选数亿个成员文库应该是可行的，允许在纳米片组装之前组合多个环形链，以获得类似于自然免疫系统的巨大化学多样性。结合这些特性，可以快速有效地发现对许多生物医学应用(如传感、诊断和治疗)很重要的病原体(如毒素蛋白、病毒和细胞)的强大识别元素。