BSA分析：GATK4的使用(包括bwa)

作者: wo_monic | 来源:发表于2019-07-20 19:36 被阅读0次

注意：版本不同，命令会不一致。一定要用对应的版本。

1.GATK的安装、使用
别人的教程
 腾讯云的教程
 GATK4数据预处理
 变异检测(BWA+SAMtools+picard+GATK)
bwa+samtools+picardtools+GATK call SNP 流程
因我们服务器渣渣的网络问题，内容都是下载到本地的win10之后，再上传到服务器上。
服务器配置：cpu 4个6核2线程=48 内存：396G
gatk是Java程序，下载到本地后解压缩即可使用。在win10使用IDM下载gatk4.0.10.1地址
存放目录

/home/chaim/disk/gatk/

unzip gatk4.0.10.1
cd gatk4.0.10.1/
chmod 777 gatk
./gatk --list          //显示gatk的所有子命令

2.GATK4.0.10.1简介
常用的pipeline有5种

Germline SNPs + Indels
种系SNP+Indel
Somatic SNVs + Indels
体细胞单碱基突变
RNAseq SNPs + Indels
Germline CNVs
种系拷贝数变异
(Copy numbervariations, CNVs)主要指大于1kb 以上的DNA片段的缺失、插入、重复等。一般是结构性变异
Somatic CNVs
体细胞拷贝数变异
1、2、4、5适合DNA测序分析，3适合RNA测序分析。’
官方文档
开始分析

GATK4.0全基因组和外显子组分析实战

软件：

fastqc检测质量
fastq/trimmomatic质控
bwa比对
samtool格式转换

数据存放位置

所有数据环境前提是在/home/chaim/disk/BSA/目录
该目录文件有

119-8-1 //119-8测序原始数据1
-A23-16551278-1279119-8_combined_R1.fastq.gz
-A23-16551278-1279119-8_combined_R2.fastq.gz
119-8-2 //119-8测序原始数据2
-A23-16551278-1279-119-8_combined_R1.fastq.gz
-A23-16551278-1279-119-8_combined_R2.fastq.gz
origin 
- B17SF2447-20_L1_358358.R1.clean.fastq_2.gz  
- B17SF2447-20_L2_358358.R1.clean.fastq.gz
- B17SF2447-20_L1_358358.R2.clean.fastq.gz
- B17SF2447-20_L2_358358.R2.clean.fastq.gz
//四个原始数据

1. 质控检测

fastqc *.fastq.gz -t 8 -o fastqc_out/

安装fastp

wget http://opengene.org/fastp/fastp
chmod 755 fastp

使用fastp质控数据

~~据传，fastp比trimmomatic速度快，效果好。姑且信之。

./fastp -i in.R1.fq.gz -o out.R1.fq.gz -I in.R2.fq.gz -O out.R2.fq.gz

#运行目录于/BSA/119-8   质控119-8的数据
../origin/fastp -i ../119-8-1/A23-16551278-1279119-8_combined_R1.fastq.gz -o ./fastp_out/119-8_1.R1.clean.fastq.gz -I ../119-8-1/A23-16551278-1279119-8_combined_R2.fastq.gz -O ./fastp_out/119-8_1.R2.clean.fastq.gz -Q --thread=5 --length_required=50 --n_base_limit=6 --compression=6 &
 ../origin/fastp -i ../119-8-2/A23-16551278-1279-119-8_combined_R1.fastq.gz -o ./fastp_out/119-8_2.R1.clean.fastq.gz -I ../119-8-2/A23-16551278-1279-119-8_combined_R2.fastq.gz -O ./fastp_out/119-8_2.R2.clean.fastq.gz -Q --thread=5 --length_required=50 --n_base_limit=6 --compression=6 &

#运行于/BSA/origin/
./fastp -i ./B17SF2447-20_L1_358358.R1.clean.fastq.gz -o ./fastp_out/2447-20_L1$.R1.clean.fastq.gz -I ./B17SF2447-20_L1_358358.R2.clean.fastq.gz -O ./fastp_out/2447-20_L1.R2.clean.fastq.gz -Q --thread=5 --length_required=50 --n_base_limit=6 --compression=6 &

./fastp -i ./B17SF2447-20_L2_358358.R1.clean.fastq.gz -o ./fastp_out/2447-20_L2.R1.clean.fastq.gz -I ./B17SF2447-20_L2_358358.R2.clean.fastq.gz -O ./fastp_out/2447-20_L2.R2.clean.fastq.gz -Q --thread=5 --length_required=50 --n_base_limit=6 --compression=6 &

fastp参数参考地址
-i R1输入双端测序数据的R1端
-o outputR1质控后输出的R1端
-I R2输入R2原始测序数据
-O outputR2质控后输出的R2端
-Q禁用质量过滤
--thread=5设置线程数为5
--length_required=50设置过滤的最短的序列长度50bp
--n_base_limit=6一个reads中N的次数大于6，则舍弃该reads
--compression=6输出的gzip文件压缩程度为6，1-9，压缩程度加大。

bwa流程参数
 bwa参考1
bwa参考2

2.1. bwa建立索引文件

/bwa的命令一定不要使用nohup。nohup 的输出信息会被bwa输出到目标文件，会影响后续步骤/

B73序列地址位置

/home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa
/BSA/bwa/zm437软连接到上述文件

 //工作目录/BSA/bwa/
bwa index -a bwtsw -p zm437 /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa

index -a bwtsw设置模式，适合大基因组
-p zm437设置输出文件名
################分割线#####################################

/#注意：此处的2.2.1和2.2.2这两步的bwa 一定要用同一版本的bwa，不然后面会报错/

2.2和2.3二选一即可，建议使用2.3. bwa的mem的效率更高，且更加准确。

2.2 bwa寻找输入reads文件的SA坐标

//工作目录/BSA/bwa/
bwa  aln  zm437  read1.fq.gz  -l 30  -k 2  -t 8  -I  > read1.fq.gz.sai
bwa  aln  zm437  read2.fq.gz  -l 30  -k 2  -t 8  -I  > read2.fq.gz.sai

//前4个是本次2447-20样品
bwa aln zm437 ../origin/fastp_out/2447-20_L1.R1.clean.fastq.gz -l 30  -k 2  -t 8  -I >2447-20_L1.R1.fq.gz.sai &
bwa aln zm437 ../origin/fastp_out/2447-20_L1.R2.clean.fastq.gz -l 30  -k 2  -t 8  -I >2447-20_L1.R2.fq.gz.sai &
bwa aln zm437 ../origin/fastp_out/2447-20_L2.R1.clean.fastq.gz -l 30  -k 2  -t 8  -I >2447-20_L2.R1.fq.gz.sai &
bwa aln zm437 ../origin/fastp_out/2447-20_L2.R2.clean.fastq.gz -l 30  -k 2  -t 8  -I >2447-20_L2.R2.fq.gz.sai &

//后4个是119-8的数据
bwa aln zm437 ../119-8/fastp_out/119-8_1.R1.clean.fastq.gz -l 30  -k 2  -t 8  -I >119-8_1.R1.fq.gz.sai &
bwa aln zm437 ../119-8/fastp_out/119-8_1.R2.clean.fastq.gz -l 30  -k 2  -t 8  -I >119-8_1.R2.fq.gz.sai &
bwa aln zm437 ../119-8/fastp_out/119-8_2.R1.clean.fastq.gz -l 30  -k 2  -t 8  -I >119-8_2.R1.fq.gz.sai &
bwa aln zm437 ../119-8/fastp_out/119-8_2.R2.clean.fastq.gz -l 30  -k 2  -t 8  -I >119-8_2.R2.fq.gz.sai &

2.2.2 sai转sam

bwa sampe -r "@RG\tID:<ID>\tLB:<LIBRARY_NAME>\tSM:<SAMPLE_NAME>\tPL:ILLUMINA"  read1.fq.gz.sai read2.fq.gz.sai read1.fq.gz read2.fq.gz > read.sam

注释：SAMPLE_NAME应替换为对应样品名称，否则会被当做一个样品处理。

//2447-20数据
bwa sampe zm437 -r "@RG\tID:2447-20\tLB:B73\tSM:2447-20_L1\tPL:ILLUMINA" 2447-20_L1.R1.fq.gz.sai 2447-20_L1.R2.fq.gz.sai  ../origin/fastp_out/2447-20_L1.R1.clean.fastq.gz ../origin/fastp_out/2447-20_L1.R2.clean.fastq.gz >2447-20_L1.sam &
bwa sampe zm437 -r "@RG\tID:2447-20\tLB:B73\tSM:2447-20_L2\tPL:ILLUMINA" 2447-20_L2.R1.fq.gz.sai 2447-20_L2.R2.fq.gz.sai  ../origin/fastp_out/2447-20_L2.R1.clean.fastq.gz ../origin/fastp_out/2447-20_L2.R2.clean.fastq.gz >2447-20_L2.sam &

//119-8数据
bwa sampe zm437 -r "@RG\tID:119-8\tLB:B73\tSM:119-8_1\tPL:ILLUMINA" 119-8_1.R1.fq.gz.sai 119-8_1.R2.fq.gz.sai ../119-8/fastp_out/119-8_1.R1.clean.fastq.gz ../119-8/fastp_out/119-8_1.R2.clean.fastq.gz >119-8_1.sam  &
bwa sampe zm437 -r "@RG\tID:119-8\tLB:B73\tSM:119-8_2\tPL:ILLUMINA" 119-8_2.R1.fq.gz.sai 119-8_2.R2.fq.gz.sai ../119-8/fastp_out/119-8_2.R1.clean.fastq.gz ../119-8/fastp_out/119-8_2.R2.clean.fastq.gz >119-8_2.sam  &

2.3 BWA的mem的使用，好用快速一步到位。参考地址(注意2.2和2.3，二选一即可，建议使用2.3)


#bwa mem的使用
/*工作目录在/home/chaim/disk/BSA/bwa/*/
/*zm437是B73基因组序列*/
/*比对的参数-R一定不能省略或写错*/
bwa mem -t 24 -M -P -R '@RG\tID:2447-20\tSM:2447-20\tLB:WES\tPL:Illumina' zm437 ../origin/fastp_out/2447-20_L1.R1.clean.fastq.gz ../origin/fastp_out/2447-20_L1.R2.clean.fastq.gz >2447-20_L1.sam &
bwa mem -t 24 -M -P -R '@RG\tID:2447-20\tSM:2447-20\tLB:WES\tPL:Illumina' zm437 ../origin/fastp_out/2447-20_L2.R1.clean.fastq.gz ../origin/fastp_out/2447-20_L2.R2.clean.fastq.gz >2447-20_L2.sam &
bwa mem -t 12 -M -P -R '@RG\tID:119-8\tSM:119-8\tLB:WES\tPL:Illumina' zm437 ../119-8/fastp_out/119-8_1.R1.clean.fastq.gz ../119-8/fastp_out/119-8_1.R2.clean.fastq.gz >119-8_1.sam &
bwa mem -t 8 -M -P -R '@RG\tID:119-8\tSM:119-8\tLB:WES\tPL:Illumina' zm437 ../119-8/fastp_out/119-8_2.R1.clean.fastq.gz ../119-8/fastp_out/119-8_2.R2.clean.fastq.gz >119-8_2.sam &

3. 对Sam文件进行重排序(recorder)

下载安装最新版picard
保存到路径/home/chaim/disk/BSA/bwa/
在该路径运行java -jar picard.jar -h,会列出picard包含的所有工具。
3.1 构建索引序列
nohup samtools faidx zm437 &
3.2对Sam文件进行重排序

java -jar picard.jar CreateSequenceDictionary R=/home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa O=zm437.dict
java -jar picard.jar ReorderSam I=2447-20_L1.sam O=2447-20_L1.reordered.sam R=/home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa &
java -jar picard.jar ReorderSam I=2447-20_L2.sam O=2447-20_L2.reordered.sam R=/home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa &
java -jar picard.jar ReorderSam I=119-8_1.sam O=119-8_1.reordered.sam R=/home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa 
java -jar picard.jar ReorderSam I=119-8_2.sam O=119-8_2.reordered.sam R=/home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa &

4.将sam文件转换成bam文件。

samtools view --threads 24 -bS 2447-20_L1.reordered.sam -o 2447-20_L1.bam &
samtools view --threads 24 -bS 2447-20_L2.reordered.sam -o 2447-20_L2.bam &
samtools view  --threads 8 -bS 119-8_1.reordered.sam -o 119-8_1.bam 
samtools view  --threads 8 -bS 119-8_2.reordered.sam -o 119-8_2.bam &

5. 对bam文件进行sort排序

java -jar picard.jar  SortSam INPUT=2447-20_L1.bam OUTPUT=2447-20_L1.sort.bam SORT_ORDER=coordinate &
java -Xmx48G -jar picard.jar  SortSam INPUT=2447-20_L2.bam OUTPUT=2447-20_L2.sort.bam SORT_ORDER=coordinate &
java -Xmx96G -jar picard.jar  SortSam INPUT=119-8_1.bam OUTPUT=119-8_1.sort.bam SORT_ORDER=coordinate
java -jar picard.jar  SortSam INPUT=119-8_2.bam OUTPUT=119-8_2.sort.bam SORT_ORDER=coordinate &

6. Merge

\\合并一个样本的多个lane的bam文件。
java -jar picard.jar MergeSamFiles I=2447-20_L1.sort.bam I=2447-20_L2.sort.bam O=2447-20.bam &
java -jar picard.jar MergeSamFiles I=119-8_1.sort.bam I=119-8_2.sort.bam O=119-8.bam

7. Duplicates Marking

测序原理是随机打断，那么理论上出现两条完全相同的read的概率是非常低的，而且建库时PCR扩增存在偏向性，因此标出完全相同的read。

java -jar picard.jar MarkDuplicates REMOVE_DUPLICATES= false MAX_FILE_HANDLES_FOR_READ_ENDS_MAP=8000 INPUT=2447-20.bam OUTPUT=2447-20.repeatmark.bam METRICS_FILE=2447-20.bam.metrics
java -jar picard.jar MarkDuplicates REMOVE_DUPLICATES= false MAX_FILE_HANDLES_FOR_READ_ENDS_MAP=8000 INPUT=119-8.bam OUTPUT=119-8.repeatmark.bam METRICS_FILE=119-8.bam.metrics

8. 生成上一步的结果的索引文件

samtools index 2447-20.repeatmark.bam
samtools index 119-8.repeatmark.bam

/#因前面的bwa的mem的R参数，我第一次运行时未设置完整，导致此处需要二次更改头文件*/
使用picard更改头文件
ID str：输入reads集ID号；LB：read集文库名；PL：测序平台（illunima或solid）；PU：测序平台下级单位名称（run的名称）；SM：样本名称。

java -Xmx96g -jar picard.jar AddOrReplaceReadGroups I=2447-20.repeatmark.bam O=2447-20.repeat.bam LB=lib2447-20 PL=illumina PU=2447-20 SM=2447-20 &
java -Xmx96g -jar picard.jar AddOrReplaceReadGroups I=119-8.repeatmark.bam O=119-8.repeat.bam LB=lib119-8 PL=illumina PU=119-8 SM=119-8 &

/一定不要手动加头文件，手动的后续无法识别。/

9.Base (Quality Score) Recalibration

Tools involved: BaseRecalibrator, Apply Recalibration, AnalyzeCovariates (optional)
参考地址
 流程参考地址
碱基质量分数重校准（Base quality score recalibration，BQSR)，就是利用机器学习的方式调整原始碱基的质量分数。它分为两个步骤:

利用已有的snp数据库，建立相关性模型，产生重校准表( recalibration table)
根据这个模型对原始碱基进行调整，只会调整非已知SNP区域。
参数列表
-R ：参考基因组
-I ：输入的BAM文件
--known-sites 已知SNP的vcf文件
-O ：输出的重校准表

java -Xmx128g -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar BaseRecalibrator -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa -I 2447-20.repeat.bam --known-sites /home/guo/maize/zm437/zea_mays_vcfsort.vcf -O 2447-20_recal_data.table &
java -Xmx128g -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar ApplyBQSR -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa -I 2447-20.repeat.bam -bqsr 2447-20_recal_data.table -O 2447-20_recal_reads.bam &

java -Xmx128g -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar BaseRecalibrator -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa -I 119-8.repeat.bam --known-sites /home/guo/maize/zm437/zea_mays_vcfsort.vcf -O 119-8_recal_data.table &
java -Xmx128g -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar ApplyBQSR -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa -I 119-8.repeat.bam -bqsr 119-8_recal_data.table -O 119-8_recal_reads.bam &

#检测上述生成的bam文件是否可用。

java -Xmx128g -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar ValidateSamFile -I 2447-20_recal_reads.bam
java -Xmx128g -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar ValidateSamFile -I 119-8_recal_reads.bam

如果显示no errors found,则可以用HaplotypeCaller call SNP/Indel.

二、GATK变异检测

参考教程地址
说明：后续会有部分命令有-nt 24这个参数，代表使用24个进程。并不是每一个命令都可以开多进程的，需要到gatk官网查询文档，搜索命令后，在命令的API文档里搜索thread即可快速查找是否能使用多线程
1.生成raw vcf 文件
参数说明
先用HaplotypeCaller生成gvcf文件，然后再运行CombineGVCFs。
java -Xmx96G -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar \ #Xmx96G 使用的最大内存
HaplotypeCaller \ #使用HaplotypeCaller模式，比较吃配置
-R /home/chaim/disk/BSA/bwa/zm437 \ #参考B73基因组
-I 2447-20.repeatmark.bam \ #若多样品，则-I sample1.bam -I sample2.bam
--dbsnp zm437vcf \ #参考B73的snp
-stand_emit_conf 10
-stand_call_conf 30
-O 2447-20.vcf
1.1生成Gvcf文件（此步非常浪费时间，需要多（3-5）个昼夜）

java -Xmx128G -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar HaplotypeCaller  -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa -I 119-8_recal_reads.bam --dbsnp /home/guo/maize/zm437/zea_mays_vcfsort.vcf --native-pair-hmm-threads 96 -stand-call-conf 30 -O 119-8.g.vcf.gz -ERC GVCF
 
java -Xmx128G -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar HaplotypeCaller  -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa -I 2447-20_recal_reads.bam --dbsnp /home/guo/maize/zm437/zea_mays_vcfsort.vcf --native-pair-hmm-threads 96 -stand-call-conf 30 -O 2447-20.g.vcf.gz -ERC GVCF

1.2合并之前生成的GVCF文件到一个文件。

java -Xmx128G -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar CombineGVCFs -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa --dbsnp /home/guo/maize/zm437/zea_mays_vcfsort.vcf --variant 2447-20.g.vcf.gz --variant 119-8.g.vcf.gz -O cohort.g.vcf.gz

1.3 GenotypeGVCFs

java -Xmx128G -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar GenotypeGVCFs -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa -V cohort.g.vcf.gz -O common.vcf.gz

2.select SNP

java -Xmx96g -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar SelectVariants -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa -O common_SNP.vcf --variant common.vcf.gz --select-type-to-include SNP  2>select_snp.err

3.select indel

java -Xmx96g -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar SelectVariants -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa -O common_INDEL.vcf --variant common.vcf.gz --select-type-to-include INDEL  2>select_indel.err

/#4.1和4.2变异过滤，是不同算法的过滤。4.1是机械参数过滤，4.2是机器学习过滤。二者选一即可/
4.1 filter SNP（变异过滤，硬过滤。）参数讲解

java -Xmx4g -jar $GATK -R $REF -T VariantFiltration --variant $Slect_SNP --clusterSize 4 --clusterWindowSize 10 --maskName aroundIndel --mask $Slest_INdel -maskExtend 3 --filterName "lowMQRankSum" --filterExpression "MQRankSum < -12.5" --filterName "highFS" --filterExpression "FS > 60.0" --filterName "lowReadPosRankSum" --filterExpression "ReadPosRankSum < -8.0" --filterName "lowMQ" --filterExpression "MQ < 40.0" --filterName "lowQD" --filterExpression "QD < 2.0" --out $Filter_SNP --genotypeFilterName "lowDP" --genotypeFilterExpression "DP < 8.0" >filter_snp.err

java -Xmx128g -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar VariantFiltration -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa --variant common_SNP.vcf --cluster-size 4 --cluster-window-size 10 --mask-name aroundIndel --mask common_INDEL.vcf -mask-extension 3 --filter-name "lowMQRankSum" --filter-expression "QUAL < 30" --filter-name "qua130" --filter-expression "MQRankSum < -12.5" --filter-name "highFS" --filter-expression "FS > 60.0" --filter-name "lowReadPosRankSum" --filter-expression "ReadPosRankSum < -8.0" --filter-name "lowMQ" --filter-expression "MQ < 40.0" --filter-name "lowQD" --filter-expression "QD < 2.0" -O common_filtration.vcf --genotype-filter-name "lowDP" --genotype-filter-expression "DP < 8.0" >filter_snp.err

4.2 变异质控VQSR,共分为两步（##此步本实验不适用，未运行。）

/本此实验不能使用该模型过滤，该模型适应于多样本的vcf质控/

1. VariantRecalibrator
  构建重新校准模型以评估变体质量以进行过滤
  （VariantRecalibrator）
2. 变异质量得分重新校准ApplyVQSR

VariantRecalibrator

 gatk VariantRecalibrator \
   -R Homo_sapiens_assembly38.fasta \
   -V input.vcf.gz \
   --resource hapmap，known = false，training = true，truth = true，prior = 15.0：hapmap_3.3.hg38.sites.vcf.gz \
   --resource omni，known = false，training = true，truth = false，prior = 12.0：1000G_omni2.5.hg38.sites.vcf.gz \
   --resource 1000G，known = false，training = true，truth = false，prior = 10.0：1000G_phase1.snps.high_confidence.hg38.vcf.gz \
   --resource dbsnp，known = true，training = false，truth = false，prior = 2.0：Homo_sapiens_assembly38.dbsnp138.vcf.gz \
   -an QD -an MQ -an MQRankSum -an ReadPosRankSum -an FS -an SOR \
   -mode SNP
   -O output.recal \
   --tranches-file output.tranches \
   --rscript-file output.plots.R

VQSR

gatk ApplyVQSR \
   -R Homo_sapiens_assembly38.fasta \
   -V input.vcf.gz \
   -O output.vcf.gz \
   --truth-sensitivity-filter-level 99.0 \
   --tranches-file output.tranches \
   --recal-file output.recal \
   -mode SNP

java -Xmx128g jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar ApplyVQSR -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa -V 2447-20.vcf -O 2447-20.vqsr.vcf &
java -Xmx128g jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar ApplyVQSR -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa -V 119-8.vcf -O 119-8.vqsr.vcf &

转换vcf为table格式

java -Xmx128g -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar VariantsToTable -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa -V common_filtration.vcf -F CHROM -F POS -F REF -F ALT -GF AD -GF DP -GF GQ -GF PL -O common.table

三、使用qtl-seqr包（可以和第四步同时进行）

以下代码为R语言代码

#安装使用QTL-seqr

#安装
installed.packages('devtools')
library('devtools')
install_github("bmansfeld/QTLseqr")

#load the package
library("QTLseqr")

#set sample and file name 
HighBulk <- "lowMQRankSum"
LowBulk <- "highFS"
file <- "common.table"

#choose which chromosomes will be included in the analysis 
chroms <- paste0
Chroms <- paste0(rep("Chr", 10), 1:10)
#Import SNP data from file
df <-
  importFromGATK(
    file = file,
    highBulk = HighBulk,
    lowBulk = LowBulk,
    chromList = Chroms
  )

#Filter SNPs based on some criteria
df_filt <-
  filterSNPs(
    SNPset = df,
    refAlleleFreq = 0.20,
    minTotalDepth = 100,
    maxTotalDepth = 400,
    minSampleDepth = 40,
    minGQ = 99
  )


#Run G' analysis
df_filt <- runGprimeAnalysis(
  SNPset = df_filt,
  windowSize = 1e6,
  outlierFilter = "deltaSNP")

#Run QTLseq analysis
df_filt <- runQTLseqAnalysis(
  SNPset = df_filt,
  windowSize = 1e6,
  popStruc = "F2",
  bulkSize = c(25, 25),
  replications = 10000,
  intervals = c(95, 99)
)

#Plot
plotQTLStats(SNPset = df_filt, var = "Gprime", plotThreshold = TRUE, q = 0.01)
plotQTLStats(SNPset = df_filt, var = "deltaSNP", plotIntervals = TRUE)

#export summary CSV
getQTLTable(SNPset = df_filt, alpha = 0.01, export = TRUE, fileName = "my_BSA_QTL.csv")

四. 使用snpEff处理gatk4输出的vcf。（此步骤和第三步骤的输出结果可以互相对比，两者具有相同的功能）
snpEff的教程

下载snpEff地址
解压unzip snpEff_latest_core.zip
我的路径是/home/chaim/bsa/snpEff/
配置玉米zm437版本的数据库
在路径/home/chaim/bsa/snpEff/snpEff/目录下创建文件夹data,

cd /home/chaim/bsa/snpEff/snpEff/
mkdir data
cd data
mkdir genomes
mkdir zm437

#在zm437目录存放基因组注释文件genes.gff,   蛋白库，protein.fa
#在genomes目录放置基因组参考序列 zm437.fa

注意上述的基因组注释文件是gff3格式。
修改snpEff.config的参数
添加如下内容

#maize genome,version zm437
 zm437.genome:maize

回到snpEFF目录，运行命令
java -jar snpEff.jar build -gff3 -v zm437

对vcf格式文件进行注释：
bwa目录存放着GATK4处理之后的文件common_filtration.vcf
在/home/chaim/bsa/bwa目录执行下面命令

 java -Xmx128g -jar /home/chaim/bsa/snpEff/snpEff/snpEff.jar zm437 common_filtration.vcf > common.eff.vcf

会输出三个文件，
snpEff_genes.txt
snpEff_summary.html
common.eff.vcf

如果想更改使用其他注释文件，
删除/home/chaim/bsa/snpEff/snpEff//data/zm437/snpEffectPredictor.bin该文件删除即可。
重新从步骤1开始即可。