实验小白必备--大肠杆菌感受态的制备

   

实验小白必备--大肠杆菌感受态的制备

转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段。在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。制备良好的感受态成为开展实验进行转化的基石。一些常用的感受态实验室不会一直订购商业感受态，所以掌握感受态的制备成为研究僧的必备技能之一。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。感受态细胞在0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，而转化混合物中的DNA形成抗DNase（DNA酶）的羟基--钙磷酸复合物，并粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，可促使细胞迅速收缩，吸收DNA复合物，完成转化。RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-80℃保存,因此CaCl2法为使用更广泛。

    注意：

    1. 细胞生长状态和密度:不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。密度过高或不足均会影响转化效率。

    2. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。

    3. 防止污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌。

    以E.coli DH5a菌株制备感受态为例：

    一、 受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100mlLB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。

    二、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)

    1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。

    2、 弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。

    3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。

    4、 感受态细胞分装成100μl的小份,液氮速冻后贮存于-80℃可保存。