为什么没有（四）？
（四）主要说的就是SAM格式，网上一搜就有，就没必要了
（五）就草草地记录了Chapter 4.1: RNA-Seq Applications - Chapter 5.2 Differential RNA-Seq
RNA-Seq的应用
生物体内的转录&翻译过程
RNA-Seq建库流程
1、提取所有的mRNA或所有的RNA
2、去除DNA（在RNA建库流程中，DNA被认为是污染物）
可选过程：去除rRNA（选择mRNA）
3、将RNA片段打断（二代测序读长问题）
4、将RNA逆转录为cDNA
可选过程：链特异性选择
5、连接adapter & PCR扩增
6、选择合适长度的cDNA
7、单端测序 或 双端测序
参考文献链接：
https://www.nature.com/articles/nrg3068
RNA-Seq的应用
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RNA-Seq实验设计
注意事项：已经降解或部分降解的RNA不可用于建库
原因：当提取的RNA被作为archival tissue储存了很长时间，同时需要注意的是短片段RNA，其3'端更加稳定。
检查RNA质量的方式：DV200指标，指片段大于200 bp的RNA的占比。
【标注】推荐DV200 ＞ 30%
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实验设计目的
RNA-Seq可以进行测序的几种RNA类型：
1、Ribo-minus：去除富集的rRNA和tRNA的RNA文库
2、使用PolyA-RNA（成熟的mRNA）进行建库
3、Strand specific/链特异性测序
【标注】一般用于挖掘novel LncRNA
测序价钱问题：一个sample 200$的情况
作为项目负责人，需要考虑的几个问题：
- SE or PE: PE getting more popular
- Depth: 20-50M for differential expression, deeper for transcript assembly or splicing.（20 million对于novel转录本和可变剪接的发现，并没有50 million的结果好）
- Read length: longer for transcript assembly, splicing, or mutation calls
4、评估biological variation
- technical replicates/技术重复：使用相同的RNA，对其测定多次；
【标注】MicroArray常用方法 - biological replicates/生物学重复：生物样本的重复
e.g. 同一株树，取3批叶片样本；患同一种癌症的人（群体）的细胞样品
【问】多少重复才足够？
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RNA-Seq中的序列比对
由于在生成mRNA过程中，存在可变剪接，因此BWA等DNA序列比对软件不适用于RNA比对。
TopHat等RNA-Seq比对软件的算法，可简单概述为：
先构建参考序列的索引，将reads比对到参考基因组的exon上，同时使用不同的junction片段构建新的数据库，再将原始数据中不能比对到exon上的reads比对到junction上。
图示如下，以09年发表的TopHat作为例子：
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比对生成的文件还是SAM/BAM格式，但是single-end和pair-end的数据存在一定差别：
- 第一列：read id
- 第二列：二进制标识符（如果是PE，则为奇数）
- 第三&四列：染色体编号 & 比对到染色体上的起始位置
- 第六列：cigar标识符，用于表示比对的具体情况
- 可选标识（e.g. XS，使用HISAT时可选，用于标识该序列来自正链 or 负链）
【例】
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RNA-Seq：比对后的QC
RNA-Seq可能存在的问题：前几个碱基的测序质量不佳。解决方案就是使用Trimmomatic等软件将reads的前几个碱基剪切掉。
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上述问题的原因，在这篇文献中有报道：https://academic.oup.com/nar/article/38/12/e131/2409775?login=true
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RNA-Seq QC也可以用于查看数据的一些信息，比如插入片段长度、reads主要比对到什么区域、TIN（transcript integrity number）、medTIN（median transcript integrity number）等。如下：
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可以在这个网站查看：http://rseqc.sourceforge.net/
看这部分的时候感觉有点懵啊，不是一般都先QC再比对吗？
RPKM, FPKM, TPM
RPKM，全称“Reads Per Kilobase Million”，用于single end RNA-Seq。
计算公式：
FPKM，全称“Fragments Per Kilobase Million”，用于paired-end RNA-Seq
计算公式：
TPM，全称“Transcripts Per Million”，现在最常用的RNA-Seq标准化方法。
我觉得看看这两篇文章差不多就ok了~
- 为什么都说RPKM和FPKM错了
- 浅谈RPKM, FPKM, RPM, TPM的区别
RSEM vs Salmon
（1）RSEM使用
输入数据：FASTQ or BAM
输出：转录本水平的表达量（e.g. read count, TPM, FPKM），该表达量计算结果基于转录组有效长度（effective transcript length），即exon的长度
【标注】effective length
计算公式：
为转录本长度，μ为插入片段平均长度
对于一条转录本，靠近5'端和3'端的部分较难被测序，因此若将此部分用于定量，会造成结果不准确。
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同时，还需要考虑到的因素是一个gene可以有多个isoform，如下图：
【标注】isoform，为exon组合得到的mRNA
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下图展示了3种不同的组织中，不同isoform的表达，同时根据reads count来估计每一种isoform在对应组织中的likelihood。
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reads count表达量，如下表：
但是由于isoform3和isoform1和2，存在很多的重叠部分，因此上述分析对isoform3 likehood的估计是不准确的。
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不通过比对也能够定量的方法 —— Pseudoalignment
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RNA-Seq Read Distribution
（1）microarray
在芯片时代，RNA-Seq测序的reads分布，一般被认为是正态分布。
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一般gene，在多个样品中的表达量分布，符合下图第三幅图：
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（2）RNA-Seq
RNA-Seq测序得到的reads分布，一般符合泊松分布。
e.g. 泊松分布
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RNA-Seq对应的表达量 —— 负二项分布
表达量越高的gene，其对应的表达量方差越大，反之亦然。
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Differential Gene Expression
当获得的测序数据，不符合normal distribution（正态分布）时，可以对数据进行转换（e.g. log-transformation）
这边设计一个非常重要的概念，实际上就是针对什么类型（属于什么分布）的数据，使用什么检验方法
图示：
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（1）microarray的标准化方式
算法：limma
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【标注】一般使用t检验或t检验的变形对gene expression进行分析
limma的输入数据
（1）reads count matrix
（2）design matrix（sample属于何种实验条件）
（3）contrast matrix（对哪几种条件进行比较）
【分析标注】采用log-normal对原始数据进行转换，导致数据变泛了，对某些条件或某些gene的检测灵敏度不高了。
（2）基于负二项分布的标准化方法
负二项分布能够很好地捕捉到测序过程中的一些bias，对真实数据有一个更好的体现。
（3）DESeq2：Modeling overdispersion
RNA-Seq一般都只有2~3个rep，但是如果想要对真实的基因表达量的方差有一个体现，上述重复数肯定是不够的。
一般情况下，对基因表达量的mean和variance进行估计，估计出的方差是大于真实值的，如下图蓝线和黑线的区别：
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差异表达基因的可视化
（1）火山图
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（2）MA图
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M：代表两种实验条件下的log ratio和log fold change
A：基因表达量的均值
后话
虽然跑过转录组，但是实际上我对其中的原理只能说是一知半解，还需要多实践。
课程得学，笔记也得做，实践也得跟上。
但是觉得笔记还是不够硬核，或许应该给自己看看就好。
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