「陈巍学基因」视频1—Illumina测序

1.二代测序
2.flow cell（流动池）有8条通道，通道内表面有两种DNA引物与两端接头以共价键连接

1.DNA文库

许多在两头接上了特定DNA接头的DNA片段形成的DNA混合物

• 两端接头为人为加上去的，且序列已知
• 中间的DNA片段序列多种多样，待测序

2.构建DNA文库

• 超声波打断基因组DNA
• 用酶补平两端
• 连接酶连接接头

3. 桥式PCR

• 文库加到芯片上，接头与芯片上的引物共价互补连接
• 加入dNTP和聚合酶，合成新的DNA链
• 加入NaOH碱溶液，DNA双链解链，接头未共价连接的链被冲走
• 加入中性液，DNA片段另一端接头与芯片引物互补连接

• 然后重复上述，DNA成指数扩增

  
  

4.把合成的双链变成测序的单链

• 把芯片上的一个引物上的特定基团切掉
• 碱溶液洗芯片，洗掉一条单链
• 加入中性乳液和测序引物

5.测序

• 加入荧光dNTP（3'端被一个叠氮基堵住，保证一个循环只能延长一个碱基）和聚合酶

  
  
  
• 用水把多余的dNTP和聚合酶冲掉
• 显微镜激光扫描，根据荧光判断碱基
• 一轮循环后加入化学试剂切段荧光基团和叠氮基团，从而暴露3'段-OH
• 加入新的dNTP和聚合酶，重复（边测序边合成）

6. 读取index（barcode）

barcode定义：在接头里做特定标记，使每个接头里有一段特定的序列，从而每一个样本都有一个特定的接头，标记样本的来源

• 用碱把上面测序完的链解链，并加入中性液
• 加入barcode引物，进行第二轮测序
• 一般测6-8个碱基就可以知道某段序列来自于哪个样本

7.双端测序（paired-end sequence）

定义：一根DNA链从正向测序一遍，再从负向测序一遍，延长有效测序长度

• 先合成互补链

• 切段原来的模版链
• 加入第二端测序的引物进行测序