今天跟大家分享的是今年一月份发表在CANCERS（IF: 6.162）上的一篇文章，主要是基于前列腺癌细胞类型特异性基因特征识别前列腺肿瘤的分化状态并监测治疗反应，在应用到人类分型的同时，也在小鼠基因工程中对实验结果进行验证，还用到了药物基因组学数据，是一篇很全面的生物信息学文章，很值得读一读哦！
A Novel Prostate Cell Type-Specific Gene Signature to Interrogate Prostate Tumor Differentiation Status and Monitor Therapeutic Response
基于前列腺癌细胞类型特异性基因特征识别前列腺肿瘤的分化状态并监测治疗反应
在这项研究中，研究者基于前列腺细胞特异性基因集(metagenes)识别前列腺癌的上皮分化状态，并识别出一组低腔上皮增生的原发性前列腺肿瘤(LumE low)。与非LumE low亚型相比，LumE low亚型往往表现出较高的Gleason评分和更高的突变负荷，无复发生存率和总生存率显著降低，并且更有可能发展为去势抵抗前列腺癌(CRPC)。研究者利用判别函数分析生成一个可用于临床的10基因预测分类器。该分类器能准确预测原发肿瘤和CRPCs的luminal status。通过针对LumE low 标记物COL4A1进行免疫实验，也证实 luminal phenotype与肿瘤转移相关。
一、前列腺细胞特异性基因的提取和解析
研究者利用已发表的人类前列腺中四种主要细胞（管腔细胞、基底细胞、间质纤维肌细胞和内皮细胞）类型的转录组数据识别前列腺细胞特异性基因。基于差异分析识别出在特定细胞类型中特异性高表达的基因(图1)，最终得到四个特异性细胞类型基因集合，基底metagene (BM)，纤维肌间质metagene (FSM)，内皮间质metagene(ESM)，腔内metagene (LM)。接着，基于上述特异性基因集合对TCGA等三套转录组数据进行ssGSEA分析(图1B)，计算出每个样本四种特异性细胞富集分数以及总富集分数。与大多数常见高LumE评分的前列腺癌相比，原发性前列腺肿瘤表现出较低的(LumE) 分数(图1B)。另外，在不同平台的数据中luminal的标准化富集分数(NES)高度一致，说明metagene方法在不同平台数据中具有可重复性(图1C)。
与包括17个不同解剖位置的其他正常组织样本(n = 613)相比，luminal metagene具有区分前列腺和非前列腺正常组织样本的能力，并且前列腺癌的luminal metagene评分比非前列腺癌肿瘤样本中得分显著升高(AUC = 1.00)(图1E)。因此, luminal metagene可以反映正常前列腺上皮细胞转录组的核心成分，并在其他组织类型中准确鉴别前列腺正常组织和恶性组织。
图1. 前列腺细胞类型特异性基因的提取及其在临床前列腺肿瘤中的应用
二、LumE low亚型预后较差，突变负荷增加
在前列腺肿瘤中，luminal特异基因被认为是监测上皮细胞分化状态的可靠工具。研究者通过单因素和多因素Cox回归分析发现，不良预后与LumE评分显著相关，与基底、纤维组织和内皮评分无关。低LumE肿瘤患者的预后比高LumE和中LumE评分患者的预后差(图2B)。另外，致命前列腺癌的LumE评分明显低于惰性肿瘤(图2C)。原发性前列腺癌中，格里森评分越高(≥8) ，LumE分数越低(图2D)。因此，低LumE评分是临床侵袭性疾病的预测指标，而其他特异性细胞基因集合对临床结果没有影响。此外，利用TCGA中的肿瘤基因组数据，研究者发现低LumE肿瘤的基因改变频率更高。其中，luminal富集程度低的肿瘤ERG基因融合、PTEN纯合缺失、TP53纯合缺失突变、MYC扩增的频率明显增高(图2E)。
图2.低腔肿瘤预后较差，突变负荷增加
三、LumE定义肿瘤亚型中特异性特征研究
研究者通过GSEA对TCGA和Taylor数据集中LumE评分高低肿瘤的差异基因进行富集分析。富集结果如图3所示，LumE较高的原发肿瘤富含前列腺癌中正常上调的基因(图3A,B)。另外，还可以发现LumE评分与腔内型或基底型乳腺癌(BC)基因上调或下调的关系(图3A)。由此可见，Luminal富集程度可以一定程度上反映前列腺上皮标志物的分化程度或丢失程度。功能注释分析显示，在LumE评分高的肿瘤中，主要富集到代谢和分泌等通路，而LumE评分低的肿瘤与增殖、有丝分裂等分子途径相关(图3C)。
对雄激素刺激（AR）的反应是正常Luminal上皮细胞的一个重要方面。因此，Luminal富集程度可以作为AR信号转导程度和AR靶向治疗敏感性的替代指标。将metagene评分系统应用于LNCaP细胞的基因表达数据显示，在雄激素刺激下，LumE评分随时间变化而增加，同时BasE评分降低。此外，在LumE评分高的肿瘤中，雄激素激活基因显著增加(图3D)，而在BasE评分高的肿瘤中，雄激素下调基因显著增加(图3D)。另外，CRPCs中LumE评分明显低于原发肿瘤(图3E)。无监督层次聚类显示luminal metagene可以从CRPCs中分离出原发肿瘤(图3F)，低LumE评分优先与CRPCs相关(图3G)。
图3. Luminal metagene得分与雄激素受体信号转导有关，在抗去势前列腺肿瘤中降低
越来越多的CRPCs，尤其是在下一代ARPI治疗后，表现出神经内分泌表型，这一现象与表型可塑性和去分化驱动治疗抗性有关。应用metagene方法，研究者发现与腺CRPCs相比，神经内分泌CRPCs (NE-CRPCs)有独立的聚类(图4A)。使用来自不同器官位置的前列腺癌转移的转录组数据，评估管腔分化的保留或丧失程度。从监督聚类分析可以看出，不同转移部位的Luminal富集程度差异很大(图4B)。骨转移瘤LumE评分较高，而淋巴结和内脏(如肝、肺)转移瘤LumE评分较低(图4C)。研究者推测，转移到骨的前列腺癌细胞保留Luminal特征和可能的AR信号转导能力，使它们对AR调节因子的反应比内脏转移更灵敏。因此，luminal metagene可以在原发肿瘤和转移性肿瘤中识别出更有可能发展为抗阉割、转移和致命的前列腺肿瘤个体。
图4. 在侵袭性和转移性前列腺肿瘤中的富集得分
四、基因集合分类器的构建及免疫组化正交验证
为便于metagene方法的临床应用，研究者使用鉴别功能分析(discriminant function analysis, DFA)得到一个分类模型，可以基于几个基因表达信息预测肿瘤属于低LumE还是非低LumE组。在TCGA数据中进行训练，Setlur等三套数据中进行验证。每套数据均被分为低LumE组，以及非低LumE组。首先选择在四套数据中均有检测的基因进行特征选择，选择在两组样本(n = 3432) 中>1.25或< 1.25的倍数变化的基因进一步分析。选择判别性能最高的10个基因构建分类器，分类器在训练数据TCGA中分类正确率高达93%，在验证数据Setlur、Taylor， Glinsky和Ehro数据集正确分类样本的百分比也比较高(图5A)。另外，预测的低LumE肿瘤显示出更高的BasE、EndoE和FibromE评分，以及较差的无复发(TCGA)和总体(Setlur)生存时间(图5B)。通过对这10个基因表达的无监督聚类分析，可以在一定程度上区分原发肿瘤和CRPCs(图5C)以及将Adeno-CRPCs和NE-CRPCs分成不同的亚型(图5D)。因此，10基因分类器是一个准确的metagene替代方法，可用于识别肿瘤标本在疾病不同阶段的表型变化。
图5. 10基因分类器的构建与验证
研究者还通过免疫组织化学(IHC)评估分类基因在原发性前列腺癌中的蛋白表达进一步验证这一发现。在分类器的10个基因中，COL4A1在低LumE肿瘤中显著升高，由于IHC的良好抗体的可用性，研究者选择一组独立的激素依赖型原发性前列腺肿瘤(n = 46)，结合临床和随访数据进行进一步的正交验证(图6A)。IHC评分在样本中存在相当大差异，COL4A1 IHC评分较高的肿瘤中，约有10%的肿瘤表现出低管腔表型(图6B)。另外，COL4A1水平高的肿瘤，Gleason评分更高（图6C)。此外，COL4A1 IHC在原发肿瘤患者中的高评分与诊断后5年内的转移显著相关(图6D)。这些数据低LumE肿瘤和较差预后之间的联系是一致的。
图6. 低LumE特征COL4A1在激素幼稚型原发性前列腺肿瘤中的正交验证
五、Luminal Metagene在小鼠实验模型中的应用
基因工程的小鼠前列腺癌模型（GEMMs）是研究前列腺癌的重要资源，为确定GEMMs是否与人类肿瘤有相似的管腔表型变异，研究者还将metagene组应用于小鼠中。这些小鼠模型概括了从前列腺上皮内瘤变(PIN)到腺癌、CRPC和转移性前列腺癌的不同病理阶段(图7A)。研究者发现，与低侵袭性小鼠模型和正常(WT)前列腺相比，具有复合致癌和抑癌基因突变的更具侵袭性的GEMMs，其LumE值显著降低(图7B)， basal metagene得分也存在差异，NPB和NPK小鼠的平均得分最高(图7C)。另外，LumE得分最低和basal metagene得分最高的NPB和NPK小鼠具有高转移性。与人类样本数据一致，LumE评分较低的小鼠肿瘤表现出较高的BasE、EndoE和FSM得分。因此， luminal metagene也同样适用于小鼠模型。
图7. Luminal Metagene在小鼠实验模型中的应用
六、人类和小鼠模型中luminal metagene研究和药物反应
利用抗癌药物治疗GEMMs前后的RNA-seq数据，研究者计算NPB, NPK, APT-P和TRAMP小鼠治疗后LumE评分的变化。结果显示，多种药物对luminal富集得分有积极影响，使肿瘤细胞进入更分化的状态(图8A)。在三种LumE初始评分最低的模型(NPB、NPK和APT-P)中，WP1066 (JAK/STAT抑制剂)和多西他赛(抗微管蛋白药物)显著提高了LumE评分。Dasanitib (Src/Bcr-Abl抑制剂)和LY294002 (PI3激酶抑制剂)在四种模型中有三种模型的LumE评分升高(图8A)。因此，治疗可以影响肿瘤的luminal分化程度，进而影响治疗效果。使用LINCS数据库中药物作用的转录组数据，研究者计算每个化合物在PC3和VCaP细胞中相应的LumE评分。在GEMMs中得分为阳性的化合物也在细胞系中同样调节luminal表型。图8B显示在两种细胞系中引起LumE和碱基评分变化的前10个化合物，该列表包括多种靶点的化合物(TOP2A/B、AMPK等) (图8C)。虽然分子靶点和预测的上皮细胞分化之间的机制联系尚不清楚，但使用这些药物可能在一定程度上促进更分化的表型并增强AR靶向治疗的有效性，但这仍然需要实验进一步验证。
图8.增强LumE得分的化合物的识别
今天的文章大概就是这些，让我们来回顾总结下吧。
识别出在四种细胞类型中高度特异表达的四组基因集合作为相应细胞特异基因（差异分析），并通过对这四组基因的ssGSEA分析进一步发现luminal metagene在前列腺癌中高度特异，LumE得分和预后以及突变负荷显著相关（预后和突变分析），在恶性程度较高的前列腺癌和转移前列腺癌中LumE得分显著降低。为将这些实验结果应用到临床，研究者又根据单样本富集分析的LumE得分将TCGA样本分成高低得分组，基于判别分析构建10基因的分类模型（分类器构建），该模型在训练数据以及验证数据中都有比较高的准确率。另外，作者还通过免疫组织化学评估分类基因在原发性前列腺癌中的蛋白表达,进一步验证这一发现（免疫组化验证），并将metagene分析应用到小鼠模型中，小鼠模型与人类模型有较高的一致性（模型验证）。最后，研究者还通过判断用药前后LumE富集得分的变化识别出可以一定程度上促进表型分化，增强AR靶向治疗药物。
今天的文献解读到这里就结束了，我们下次再见。
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