本次主要介绍透化、反转录、cDNA合成及文库构建，需要1-1.5天。样本准备以及固定染色之前已经详细介绍过了。
样本冷冻包埋，H&E染色或荧光免疫染色，然后经TO实验确定了组织透化的最佳时间，最终可以进行后续的正式实验。
一、玻片简介
两种类型，分别有两个或四个捕获区，捕获区是6.5X6.5 mm，四周有基准线，8X8 mm，每一个捕获区上有5000个spots，每个spot上的primers包括Illumina TruSeq Reas1，16 nt Spatial Barcode，12 nt unique molecular identifier (UMI)，30 nt poly(dT) sequence。
Tips
- 1、试剂在使用前要完全混匀，保存条件根据推荐温度存放；
- 2、移液器需要校准，确保其准确性；
- 3、玻片上每一个spot包含的引物都是带有Spatial Barcode；
- 4、玻片的保存运输条件一定要适合的环境，包含有组织的玻片在-80℃仅能存放四周；
- 5、玻片的操作过程一定需要按照建议进行，保持玻片正面朝上，不要触碰到组织，玻片浸入时要完全没过组织，不放置在平的操作台上；
- 6、玻片卡夹的安装和使用同样按照protocol进行，先使用普通玻片进行练习；
- 7、玻片需要多次使用，使用后，需要清洗干净；
- 8、Slide Seal的使用一定要小心，避免液体溅出；
- 9、玻片在不同的温度的孵育过程，保持台面平整；
- 10、磁力分离器，分高和低，在使用过程中要注意；
- 11、Beads的去除过程，直至澄清，具体时间是不同的。
二、透化及反转录、第二链合成及变性（前两步是在玻片上进行）
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Step 1：每个捕获区可以放置不同的组织。如果四个捕获区组织的通透时间不同，从通透时间最长的开始加入70 μl透化酶处理固定及染色后的玻片，37 ℃（PCR仪的盖需要盖上），具体时间与TO优化后的时间一致；
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Step 2：加入75 μl RT Master Mix，53℃，45min进行反转录，spots上的引物捕获mRNA；
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Step 3：加入75 μl Second Strand Mix，65℃，15min进行第二链合成；
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Step 4：将每个孔中的样本回收到加有Tris的tube中。
三、cDNA扩增和质检
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Step 5：在cDNA扩增前，需要对二链cDNA进行定量（因为浓度极低，Qubit，Nanodrop的定量不够灵敏，需使用qPCR进行），确定cDNA的扩增循环数（不需要标准品和重复），将RFU峰值的25%为阈值处Cq值为所需循环数，不同组织不同，大部分为10-20个循环；
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Step 6：扩增后的cDNA可以在4℃，保存72h，-20℃保存一周；
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Step 7：采用SPRIselect试剂对cDNA纯化；
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Step 8：取1μl样本进行质检，可以是Bioanalyzer、TapeStation或者LabChip。
四、空间转录组文库构建
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Step 9：取10μl cDNA（25%）进行后续的建库构建，片段化，32℃，5min，然后65℃，30min末端修复和加A碱基，磁珠双端筛选，加接头，Sample Index PCR补齐。
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Step 10：文库质检采用Bioanalyzer，TapeStation以及LabChip进行，文库大小分布300-600bp之间，主峰为450bp。
五、测序
文库可以在Illumina所有测序平台上进行，文库包括i5和i7双端index，选择双端测序，R1：28 cycles，Spatial Barcode和(UMI)，i7 index：10 cycles，i5 index：10 cycle，Read2：90 cycles，mRNA插入片段。不与其他单端index混合测序。
关于测序深度，建议5k reads pairs/spot，可以根据组织覆盖程度计算测序量。可以将H&E染色图片导入Loupe Browser，圈出组织，自动计算spots数量和所占比例。
但是不同组织RNA的表达水平不同，所以建议只是起点，需要根据不同的组织类型，大小及质量，以及想到达到的饱和度进行调整。
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