今天的这篇文章来自于今年7月份发表在nature biotechnology上的一篇文章<Simultaneous quantification of protein-DNA contacts and transcriptomes in single cells>
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这是一篇方法学的文章，和之前的探究机制的文章是有些许不一样，在于这个技术的流程，和用这个技术能解决什么问题！
在单细胞的水平上,作者开发出来一种技术ScDam&T-seq，这种技术，可以同时探究转录组和蛋白和DNA之间的关系。
背景知识介绍：
1 ：细胞的异质性一直是探究DNA-蛋白互作关系的主要问题，现在单细胞手段可解决细胞异质性的问题。
2：DamID可以利用大肠杆菌中的Dam（DNA甲基转移酶）蛋白的表达，它可以特异性的识别GATC motif，从而甲基化A，可以利用这个技术去探究蛋白-DNA之间的相互作用。不了解DamID的看这里
3：通过线性的扩增，可以让DamID和RNA-seq的文库同时进行扩增，不需要对基因组DNA进行打断。
文章的亮点及主要的结论
1：他们利用了ScDam&T-seq这个技术，探究了单个细胞的genome-lamina(基因组-核纤层)之间染色质的凝集和基因表达的情况
2：在单细胞的水平上，探究了RING1B蛋白和DNA表达情况。
3：在不同的培养条件下，可以利用这个技术探究不同的老鼠胚胎的干细胞表达状态
4：可以利用这个技术去分析蛋白介导-细胞特异性的分析
part 1
文章思路
part2
workflow
1：是利用流式分选技术，分选出单细胞，然后把他们分道384孔板里面。然后会进行细胞裂解。
2：首先是进行RNA建库，因为mRNA是带有polyA尾巴的，那么首先利用mRNA primer（带有polyT ，P5，T7，UMI，sample barcode）结合RNA进行反转，第一条链合成
3：以第一条链为模板，合成第二条链。
4：用Dpn1去切全基因组DNA，它可以识别GATC motif,然后可以切开甲基化的A，这样就可以切断全基因组DNA
5：连接上DamID的adapter，DamID的adapter带有fork(4--6nt),T7,P5,UMI,sample barcode
(T7,P5是为了和测序仪芯片连接的，UMI unique molecule identification,是为了区分同一样本里的不同的RNA，sample barcode是为了区分不同细胞的reads)
6：一个孔里面的转录本和DamID都已经连接好了，接下来进行体外的线性扩增~
part3
结论一：证明ScDam&T-seq这个技术的可行性
Fig1ScDam&T-seq的结果和其他单细胞的结果进行比较，发现比较好的一致性
b图就是拿ScDam&T-seq和ScDamID进行比较。可以看到比较好的一致性，黑点是OE值（观察值（有Dam信号的reads）/期望值（WGS数据）大于1的就会是黑点）
c图是说大概有多少距离可以有Dam的信号，然后可以看到到这两种技术一致性也很好
d,e图是关注转录组的质量问题，拿cel-seq进行比较（cel-seq的原理和ScDam&T-seq的RNA建库的原理是类似的）可以看到ScDam&T-seq和cel-seq的一致性比较好，图e是用了不同的adapter的浓度去比较建库结果。
结论二：Dam信号可以作为染色质松散的结构的标记
首先他们得构建Dam表达的细胞系，并且得证明他们的细胞系work
supp Fig3a b auxin-induceible Dam expression model
他们构建了一个生长素诱导的Dam表达的细胞模型，然后和其他的发表的公共数据进行比较。证明他们的系统是work的。
Fig2 Dam信号可以作为染色质松散的结构的标记
他们接下来发现了，在TSS附近，伴随着转录的信号增强，Dam的信号也会增强。说明Dam的信号值可能成为转录活跃的marker。但是为了排除是不是序列的原因，他们用了一种限制性内切酶AluI去切DNA序列（这种限制酶识别的位点是AGTC,然后再G处可以进行酶切，得到和Dam酶切一样的末端）他们发现，便随着转录上升，没有看到酶切信号增强。所以说明，可能是因为染色质的空间构象，导致了转录的活跃变化。，而且Dam信号还和增强子的有关系，增强子处的Dam的信号增强。接下来，他们想看genome-lamina的互作和转录之间的关系，他们构建了一个Dam-laminB1的融合蛋白，发现伴随着CTCF的结合区域的区域分值越高，Dam的信号也越强。（图de）而且最后，联合Dam的信号和转录组来看，结果发现Dam信号越强，转录越活跃。
结论三：整体看转录组和染色质凝集的状态
image.png
首先他们将拿到的结果进行矩阵变换后，找到mapping和unmapping的区域进行对比（图ac,Dam-laminB1的结果，黑点表示OE>1，说明有Dam信号高，这块的laminaB的信号比较高。白点表示OE<1）结果比较转录活性，可以看到的时白点的转录活性比黑点的转录活性高。说明lanmiaB的转录活性和其他区域进行比较的，活性低。图bc都是说Dam-laminaB1和Dam信号进行比较。用Dam做对比，说明Dam-LaminB1信号强的地方，转录越不活跃。
此外，他们通过分析公共数据，发现，当contract frequency（CF）越低，H3K9me3，fLADs的值就越低，当CF越高，H3K27me3，cLADs的值越高，这些都是兼性异染色质的marker。
supp fig5e,f
结论四：ScDam&T-seq 可以分析细胞特异性的基因调控
首先他们利用不同的培养基去培养小鼠的胚胎干细胞（血清和2i两种培养环境）,利用ScDam&T-seq 进行分析，首先他们分析了这两种情况下的基因上下调的关系，然后发现了一个下调基因PEG10的在TSS附近和gene body附近有富集，在c图种可以看到两种培养情况下的基因上调或者是基因下调表达的基因统计。
Fig4a-c
然后他们找到了一个polycome 家族的蛋白PRC1亚基RINGB1的chip-seq数据（bulk）和单细胞的Dam数据进行比较，发现Dam数据的重复性比较好。而且做了其他基因比较如HOX家族的基因比较。
Fig4 de
选了一个父源的印记基因和母源的印记基因进行比较，这两个印记基因分别是129/Sv 和CAST/EiJ ，这两个基因可以用于去探究X染色体失活，他们观察到X染色体失活和RINGB1升高和H2K119的泛素化是一致的。这些都表明，ScDam&T-seq可以去系统的研究单个细胞中X染色体失活的调节机制
对于文章的思考
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