第一代测序—Sanger法测序又称双脱氧法测序

陈巍学基因-第一代DNA测序

ABI公司BigDye测序方法的基本原理

• ABI公司根据双脱氧法进一步开发出，荧光标记的双脱氧法测序试剂盒即BigDye^TM试剂再结合毛细管电泳生产出ABI 3730和 ABI 3500等测序仪。

---

一、双脱氧核苷酸（ddNTP）分子的由来：

---

image.png image.png image.png

缺少3'位的羟基的ddNTP结合到DNA链上，会使得后面的单脱氧核苷酸（dNTP）无法再聚合上来，致使聚合反应终止。

image.png

---

二、测序步骤

---

第一步：加入bigdye试剂（包含四种带荧光标记的ddNTP、四种dNTP、DNA聚合酶、镁离子、ph缓冲液等。）进行聚合反应。
在进行聚合反应时，有可能结合上ddNTP且终止反应，也有可能结合上正常dNTP正常反应，直到结合上ddNTP终止反应。反应结束生成长短不一的含有荧光标记的DNA片段混合物（荧光颜色（代表的碱基）与模板的碱基有互补对应的关系）。

image.png
image.png
第二步： 过滤混合物，去除ddNTP等其他杂质，只留下长短不一的DNA片段。
第三步：上机测序
1）先在长长的中空的玻璃毛细管中注入丙烯酰胺溶液，用紫外光照射丙烯酰胺溶液发生聚合反应变成聚丙烯酰胺凝胶。

聚丙烯酰胺凝胶对于在其中电泳的核酸有分离作用,短的片段在其中电泳得快，长的片段在其中电泳的慢。

2）把DNA片段混合物，加到有聚丙烯酰胺凝胶的毛细管的一段，在毛细管的两端加上高电压，DNA片段就在电场的作用下，从负极向正极电泳。
3）在毛细管正极的末端，用激光进行照射，并用分光的光学传感器把不同颜色的荧光强度记录下来。每个DNA片段在经过激光点扫描时，它上面带有的荧光基团就会发出特定颜色的荧光。

image.png

峰越高、越尖，与别的峰的交错越少，则这个碱基判读准确性越好。

第一代测序—Sanger法测序又称双脱氧法测序

• ABI 3500测序仪一般可以测到850个碱基（长度）或者更长片段的碱基序列。ABI 3730测序仪一般可以测到700个碱基（长度）或者更长片段的碱基序列。