导读

1. 宏转录组概念：

• 宏转录组测序是对某一特定时期、特定环境样品中的全部微生物的RNA进行高通量测序，直接获得该环境中所有微生物转录组信息的一种测序技术的新应用。宏转录组中不仅包含有微生物的物种信息，还有微生物的基因表达信息。如果说宏基因组能告诉我们微生物群，那么宏转录组则能告诉我们这些微生物，这有助于挖掘微生物功能基因和探索微生物与环境、疾病、动植物等关系的机制。

2. 宏转录组分析

• 从以G为单位的高通量测序数据中获取研究所需的微生物种类、基因、通路等信息是进行宏转录组研究必须经历的一步。现在网络上分析组学数据的工具五花八门。能否从众多组学工具中选择出适合分析宏转录组数据的软件，能否搭建一套完整、快速、高效、灵敏、高精确的宏转录组分析pipline，直接关乎到后期数据分析的进行。

• 2018年发表在Briefings in Bioinformatics [PMID: 28481971] 上的一篇综述介绍了常见的四款宏转录组分析pipline：，，，。下面介绍一下这四款pipline中所采用的核心算法/工具、数据库和核心步骤。

一、Leimena-2013

1. 文章：
A comprehensive metatranscriptome analysis pipeline and its validation using human small intestine microbiota datasets.
BMC Genomics. 2013

2. 核心算法/工具：

• SortMeRNA：去除16S，23S，18S，28S rRNAs序列的常用工具。

• BLASTN：用于核酸序列比对的一个模块，速度慢于 MegaBlast，但是功能更强。

• MegaBLAST：经典比对软件BlAST的子模块，速度快，能找出相似度比较高的序列，一般用于同一物种内部或者分歧不太远的物种之间。

• KAAS：KEGG自动注释服务器。
  链接：http://www.genome.jp/tools/kaas/

3. 数据库：

• SILVA：细菌、古菌、真菌等微生物分类数据库，包含maker序列和注释信息。

• COG：Cluster of Orthologous Groups of Proteins，蛋白相邻类的聚簇数据库。

• MetaHIT：人类肠道宏基因组数据库 [Nature 2010]。

• 人类小肠宏基因组数据库 [ISME J 2012]。

• KEGG：京都基因与基因组百科全书，包含生物代谢、通路等功能信息的数据库。

4. 核心步骤：

1. 用SortMeRNA和默认的rRNA数据库去除16S，23S，18S，28S的rRNAs序列。
2. 用BLASTN和SILVA、NCBI数据库去除剩下序列中的细菌、古菌、真核生物的tRNA/rRNA序列。
3. 去除Illumina Phix control序列和adaptor序列。
4. 用MegaBLAST 和BLASTN进行mRNA与NCBI数据库（含3979个细菌和古细菌的全基因组或基因组草图）的比对确定mRNA序列的物种发生起源（科/属水平）。
5. 将至少50%比对到基因ORF的序列定义为“基因/编码序列”，少于50%的序列定义为“非编码/基因间序列”，然后用BLAST 、KEGG自动注释服务器KAAS、COG数据库、KEGG数据库进行编码序列的功能注释和代谢分析。
6. 调整BLASTN的参数，用NCBI蛋白数据库、MetaHIT蛋白序列数据库、人类小肠宏基因组数据库、KEGG、COG进一步挖掘4）中“Unassigned mRNA序列”的功能。

二、HUMAnN2

1. 文章：
Species-level functional profiling of metagenomes and metatranscriptomes.
Nat Methods 2018

• HUMAnN2介绍：http://huttenhower.sph.harvard.edu/humann2
• HUMAnN2使用：https://bitbucket.org/biobakery/hmp2_workflows/src/master/

2. 核心算法/工具：

• Bowtie2：是将测序reads与长参考序列比对工具 (适用于将长度大约为50到100或1000字符的reads与相对较长的基因组)。

• MetaPhlAn2：可以基于宏基因组数据，获得微生物群体中种水平精度的组成，包括细菌、古菌、真核生物和病毒。如果有株水平基因组的物种，也可以追踪和研究。

• MinPath：是一种使用蛋白质家族预测进行生物通路重建的节俭方法，为查询数据集实现更保守、更可靠的生物通路估计。

• DIAMOND：一种新的高通量程序，可将DNA序列或蛋白质序列与NR等蛋白质参考数据库进行比对，速度可达BLAST的2万倍，具有很高的灵敏度。

3. 数据库：

• UniRef：UniProt Reference Clusters（UniRef），是蛋白参考数据库。UniRef对来自UniProtKB的各种数据包括各种剪接变异体进行了分类汇总，还从UniParc中选取了一些数据以求能收录更多数据，同时也保证没有冗余数据。

• MetaCyc：是一个代谢通路数据库，包含来自3009个不同生物体的2722条通路。

• ChocoPhlAn pangenome：泛基因组数据库，含细菌、古菌、真核生物、病毒的注释信息。

4. 核心步骤：

1. 用KneadData、Bowtie2、Trimmomatic和hg38 mRNA数据进行序列过滤，去除低质量碱基、序列和宿主序列。
2. 用MetaPhlAn2和ChocoPhlAn泛基因组数据库进行物种分类鉴定。
3. 用MinPath、DIAMOND和UniRef、MetaCyc数据库进行基因家族、功能和通路的注释。

三、MetaTrans

1. 文章：
MetaTrans: an open-source pipeline for metatranscriptomics.
Sci Rep. 2016

• MetaTrans链接：http://www.metatrans.org/

2. 核心算法/工具：

• Kraken：能利用基于k-mer的精确比对方法和庞大的微生物基因组参考数据库（>8500种微生物）超高速、高正确性和精确性地将微生物注释到属及更低的水平。

• SortMeRNA：去除16S，23S，18S，28S rRNAs序列的常用工具。

• UCLUST：能以USEARCH作为序列比对引擎进行序列聚类。

• SOAP2：是SOAP（Short Oligonuclotide Analysis package）的一个主要成员，能进行高速短核酸序列比对。

• FragGeneScan：是在短序列中找到基因的一种基因注释程序，也可用于在完整或非完整基因组中的预测原核生物的基因。

3. 数据库：

• SILVA-115：SIVLA微生物分类注释数据库（2013年版）。

• Greengenes-13.5：Greengenes微生物分类注释数据库（2013年版）。

• Rfam-11：用来鉴定non-coding RNAs的数据库。

• tRNA-all：用来鉴定tRNA数据库。

• MetaHIT：包含1250人的，由EggNOG数据库注释好的的宏基因组数据库。

• M5nr：包含MG-RAST服务器提供的、1590万个独特的蛋白质和580万个来自IMG、Genbank、InterPro、KEGG、PATRIC、Phantome)、RefSeq、SEED、UniProt的功能注释。。

4. 核心步骤：

1. 用SortMeRNA和SILVA v11527、Rfam28、Genomic tRNA database数据库进行rRNA/tRNA清除。
2. 用Fastq-Join将有overlap的双端序列merge成更长的序列。用FragGeneScan进行基因预测，丢弃非编码基因的序列，降低计算成本。
3. 使用SOAP2和MetaHIT、M5nr数据库进行功能注释。
4. 使用UCLUST对1）中舍弃的rRNA序列进行聚类，使用SOAP2、QIIME和Greengenes数据库进行微生物分类学分析。

四、SAMSA

1. 文章：
SAMSA: a comprehensive metatranscriptome analysis pipeline.
BMC Bioinformatics. 2016

• SAMSA GitHub链接：https://github.com/transcript/SAMSA

2. 核心算法/工具：

• Trimmomatic：去除测序数据中接头、引物、低质量碱基和序列的质控工具。

• FLASH：一种快速、准确的能通过序列重叠区将双端测序得到的上、下游序列合并到一起以增加读长的软件。

• MG-RAST：Metagenomic Rapid Annotations using Subsystems Technology物种分类和功能分析服务器 链接：http://www.mg-rast.org/

3. 数据库：

• NCBI RefSeq：NCBI基因组数据库。

• SEED Subsystems reference database：是能将FIGfam（蛋白质数据库）中定义的基因家族分成多个功能级别的一种基因分层方法。

4. 核心步骤：

1. 使用Trimmomatic去除原始测序数据中的低质量碱基、序列和测序接头。
2. 使用FLASH对齐（align）的功能将质控后的双端序列拼接成一条更长的序列（文章中提到约32-54%的双端序列能成功对齐）。
3. 使用NCBI RefSeq和MG-RAST进行序列注释。MG-RAST包括几个步骤，包括通过SolexaQA进行初始序列质量控制检查，通过FragGeneScan进行基因注释，通过QIIME的uclust进行90%一致性的氨基酸序列聚类，然后在每个蛋白质序列聚类上使用sBLAT找到最佳匹配的参考信息。