WES/WGS，call变异流程学习。

第一步，QC

传统方法，FastQC

安装

$ wget https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/fastqc_v0.11.5.zip ./

FastQC的运行非常简单，直接在终端通过命令行是最有效直接的，下面我给出一个例子：

$ /path_to_fastqc/FastQC/fastqc untreated.fq -o fastqc_out_dir/

命令比较简单，这里 唯一值得注意的地方就是 -o 参数用于指定FastQC报告的输出目录，这个目录需要事先创建好，如果不指定特定的目录，那么FastQC的结果会默认输出到文件untreated.fq的同一个目录下。它输出结果只有两个，一个html和一个.zip压缩包。

切除测序接头序列和read的低质量序列

$ java -jar trimmomatic-0.36.jar
Usage:
       PE [-version] [-threads <threads>] [-phred33|-phred64] [-trimlog <trimLogFile>] [-quiet] [-validatePairs] [-basein <inputBase> | <inputFile1> <inputFile2>] [-baseout <outputBase> | <outputFile1P> <outputFile1U> <outputFile2P> <outputFile2U>] <trimmer1>...
   or:
       SE [-version] [-threads <threads>] [-phred33|-phred64] [-trimlog <trimLogFile>] [-quiet] <inputFile> <outputFile> <trimmer1>...
   or:
       -version

具体看数据质控

fastp

fastp的特性：

对数据自动进行全方位质控，生成人性化的报告
过滤功能（低质量，太短，太多N……）;
对每一个序列的头部或尾部，计算滑动窗内的质量均值，并将均值较低的子序列进行切除（类似Trimmomatic的做法，但是快非常多）;
全局剪裁 （在头/尾部，不影响去重），对于Illumina下机数据往往最后一到两个cycle需要这样处理;
去除接头污染。厉害的是，你不用输入接头序列，因为算法会自动识别接头序列并进行剪裁;
对于双端测序（PE）的数据，软件会自动查找每一对read的重叠区域，并对该重叠区域中不匹配的碱基对进行校正;
去除尾部的polyG。对于Illumina NextSeq/NovaSeq的测序数据，因为是两色法发光，polyG是常有的事，所以该特性对该两类测序平台默认打开;
对于PE数据中的overlap区间中不一致的碱基对，依据质量值进行校正;
可以对带分子标签（UMI）的数据进行预处理，不管UMI在插入片段还是在index上，都可以轻松处理;
-可以将输出进行分拆，而且支持两种模式，分别是指定分拆的个数，或者分拆后每个文件的行数

具体看fastp

对于多样品的质控，一个一个看报告显然不可行。这里需要用multiqc

其强大的功能主要体现在以下三个方面：
1）能将测序数据的多个QC结果整合成一个HTLM网页交互式报告，同时也能导出pdf文件；
2）支持多种分析类型的质控结果查看，如：RNAseq、Whole-Genome Seq、Bisulfite Seq、Hi-C和MultiQC_NGI；
3）支持整合68种软件分析的结果，而且支持的软件还在持续增加，也可以自己写作一个插件，具体见下图。

比对

bwa
bwa主要用于将低差异度的短序列（一般是同物种）与参考基因组进行比对。主要包含三种比对算法：backtrack、SW和MEM，第一种只支持短序列比对（<100bp），后两种支持长序列比对(70bp~1M)，并支持分割比对（split alignment）。MEM算法是最新的也是官方推荐的。
先建bwa的索引

bwa index -a bwtsw -p gatk_hg38 ~/reference/genome/gatk_hg38/Homo_sapiens_assembly38.fasta &

比对

nohup bwa mem -t 4 -R '@RG\tID:KPGP00216\tPL:illumina\tLB:WGS\tSM:KPGP00216' ~/reference/index/bwa/gatk_hg38/gatk_hg38 KPGP-00216_L1_R1.clean.fq KPGP-00216_L1_R2.clean.fq 1>KPGP-00216_L1.sam 2>/dev/null &

GATK 4.0 WGS germline call variant

WEScall variant的流程与之差不多

samtic call snv

可以参考的两篇博文
GATK4-mutect2来call somatic mutation
Mutect2-肿瘤不同转移时期的免疫微环境异质性研究

注释

snpeff
相关介绍