384孔荧光定量（qRT-PCR）实验优化方案

Author：J.F.XIE
Date：23-03-2021

384孔荧光定量的普及，使得批量检测基因变得更加便捷、高效，极大地提升了实验效率。传统手动加样需保持精神高度集中，初学者往往因为移液操作不熟练导致加样不均，加样错孔更导致实验失败，种种弊端制约了荧光检测的效率。在当前实验室条件下，通过采用专用的设备耗材，进行合理的排版和运算，即可实现批量操作，下文给出具体方案。

专用设备耗材三件套：

A：ABI 384 PCR板：

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B：八联排移液器：

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C：巴洛克加样槽

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1. 384PCR反应体系：

cDNA	2ul
F/R Primer	0.4ul
SYBR Mix	5ul
H2O	2.2ul

2. 添加预混液（引物、Mix和H2O）

常规的排枪为8Tips，其间距与96孔板、10ul枪头座间距相一致；
而384孔间距为正常PCR板的1/2。
因此，加样时候，必须间隔一孔加样。
由于移液损失等原因，手动加样建议"满10添1"，而排枪加样建议"满6添1"（笔者经验）。

例如，荧光检测RNAi干扰Vg基因，EGFP做对照，每个处理6个生物重复，3个技术复孔。


首先按照反应体系配置预混液，均匀分装到12孔加样槽内（此处只用到了6槽），每槽加样56ul，然后使用排枪将预混液依次加入到对应的384孔内。当总预混液体积少时更推荐用酶标板或八联排PCR管。
然后同样操作加入cDNA样。

3. 排版示意图及操作：

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Step1.
添加内参预混液，黄色色块；

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Step2.
添加内参预混液，红色色块；

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Step3.
添加检测基因Vg预混液，深蓝色色块；

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Step4.
添加检测基因Vg预混液，紫色色块；

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Step5.
cDNA稀释液按照对应次序排列，切记间隔加样。依次按照预混液加样顺序，添加模板cDNA即可。

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评价：

1. 传统加样耗时费力，对操作技巧、体力等有较高要求。如果环境温度过高，加样周期长，部分液体挥发，导致复孔之间差异较大，为后续分析带来不便。视野在模板和加样孔之间来回切换，容易视觉疲劳，导致加样错误。

2. 较传统手动单孔加样，排枪加样只需要提前计算好加样体积，并将预混好的反应液提前分装到加样槽内，然后间隔加样。计算好体系，依次按照排版加样，效率显著提升，并且避免手动加样错位，复孔之间重复性更稳定，结果更稳健。