之前我们介绍了一项整合多维组学通路分析的工作ActivePathways，能够在多个数据集中识别到显著富集的通路，包括那些在单个数据集中不明显的通路。今天来介绍一下这个R包的使用方法和使用输出文件进行Cytoscape绘制网络图。

下面这个图就是ActivePathways工作中对乳腺癌样本分析的绘图，下面就教大家怎样进行数据分析以及绘制这种节点为饼图的网络图~

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R包介绍

ActivePathways的输入文件只需要两类，一个是p-values（之前我们介绍过，这里的P值可以是差异基因表达、基因必要性、突变或拷贝数变异负荷等的显著性P值）的数值型矩阵（该矩阵不能包含缺失值），另一个文件是一个GMT格式的基因集。

R包中示例文件：
（1）Adenocarcinoma_scores_subset.tsv

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关于该文件中NA值，在下面R包程序中有做处理
（2）hsapiens_REAC_subset.gmt

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1.整合通路分析

安装包

devtools::install_github('https://github.com/reimandlab/activePathways')
library(activePathways)

scores <- read.table('D:/R/R-3.6.2/library/activePathways/extdata/Adenocarcinoma_scores_subset.tsv', header=TRUE, row.names='Gene')
scores <- as.matrix(scores)
#######fix(scores)
#######scores就是上文介绍的Adenocarcinoma_scores_subset.tsv
scores[is.na(scores)] <- 1 #给缺失值赋值1
#######因为矩阵中数值是P值，所以赋值的1在这种情况下是极端值了
result <- activePathways(scores,
#scores是P值数据，行是基因，列是tests 'D:/R/R-3.6.2/library/activePathways/extdata/hsapiens_REAC_subset.gmt',
#读入GMT文件
geneset.filter = c(5, 1000),
#注释基因集的下限和上限
cutoff = 0.1,
#用于富集分析的基因的最大P值
merge.method = "Fisher",
#对基因p值进行合并的方法，可选"Brown", "Fisher"
significant = 0.05,
#显著富集通路的最大p值
correction.method ="bonferroni",
#校正P值的方法，可选"holm", "fdr", "hochberg", "hommel", "bonferroni", "BH", "BY", "none"
cytoscape.file.tag = "C:/Users/DELL/Desktop/results"
#是否生成cytoscape可用的文件
)
fix(result)

输出result数据：

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term.id:条目的id
term.name:条目的全称
adjusted.p.val:校正后的P值
term.size:注释到该条目的基因数
overlap:条目和查询基因之间重叠的基因
evidence:scores列是用来通路富集的。对每一列scores都要分别进行评估以便富集，如果发现了通路，则添加到evidence列

2.生成Cytoscape文件
activePathways会生成4个用于Cytoscape 的EnrichmentMap和enhancedGraphics apps构建网络的文件。
注：上述例子中“cytoscape.file.tag = "C:/Users/DELL/Desktop/results"”语句用于生成生成Cytoscape文件。

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（1）pathways.txt：与P值显著相关的terms列表（校正富集P值后的）
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（2）subgroups.txt：该矩阵表示当只考虑scores的一列时，是否发现显著的通路。A1表明，仅使用该列来进行富集分析，该term是显著的。
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（3）pathways.gmt：提供的gmt文件的缩减版，仅包含 pathways.txt中的terms
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（4）legend.pdf：图例展示scores列及匹配颜色
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Cytoscape绘图

1. 在Cytoscape中安装Enrichment Map app
   Cytoscape是我们生信网络分析最常用软件，https://cytoscape.org/可直接下载。我使用的是Cytoscape_3_8_0版本，运行需要安装JAVA 11环境。

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2. 上传Enrichment Map构图文件
   使用 terms文件 (pathways.txt)和缩减版的gmt文件 (pathways.gmt)在Cytoscape中创建一个富集图示。
   

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   可以看到展示初步的网络图，此时节点信息还不完全。节点越大代表富集基因越多，节点颜色代表P值显著性。
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3. 调整网络图
   （1）上传(文件>导入>表>文件)子组文件(subgroups.txt)。这里主要目的是对节点进行调整，用饼图赋予P值来源信息（CDS、X3UTR、promCore、combined）。
   

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（2）在“style”面板下，设置image/Chart1使用饼图，重置节点信息。

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（3）修改饼图组成颜色

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小编总结

可以说ActivePathways是一款非常方便实用的通路分析工具了，关于其方法思路等我们之前有介绍过，这里就不多说了。该包提供的cytoscape作图文件简直太好用了，对于网络图一些其他细节的修改，比如标签、边的粗细颜色形状、节点透明度之类的，小编这里就不赘述了，大家快去试试玩玩吧！

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