近日，做差异分析的时候，想着看一下样本本身的特征是以什么分类的，除了计算样本之间的距离，还用到的PCA（主成分分析）。在DESeq2包中专门由一个PCA分析的函数，即plotPCA，里面的参数也比较简单。

plotPCA参数

object：对象

在进行PCA之前是要进行归一化的，因为在降维映射的过程中， 存在映射误差， 所有在对高维特征降维之前， 需要做特征归一化（feature normalization）, 这个归一化操作包括： （1） feature scaling (让所有的特征拥有相似的尺度， 要不然一个特征特别小， 一个特征特别大会影响降维的效果) （2） zero mean normalization (零均值归一化)。、
但是在DESeq2包中实际上已经有了归一化的方法，rlog和vst，具体是怎么做到归一化的，这个原理不了解。
在使用的需要根据样本量的多少来选择方法。样本量少于30的话，选择rlog，多于30的话，建议选择vst。亲测！样本量多于30的时候，用了rlog，出现以下提示：

rlog() may take a few minutes with 30 or more samples,
vst() is a much faster transformation

所以官方就会建议样本量大于30的时候用vst，而且vst速度是飞起的状态，而rlog是老牛拉慢车。

intgroup：分组

官方解释：interesting groups: a character vector of names in colData(x) to use for grouping。也就是在构建dds的时候的分组，实际上这个分组最后影响的是PCA图中的颜色，但是并不影响PCA图中各个样本的位置。换句话说，PCA降维的是时候并不会考虑这个分组。这个也是我搞了好多天才弄清楚的，所以原理还是要搞懂的，不能只会跑流程。

ntop：用于主成分分析的时候基因数

官方解释：number of top genes to use for principal components, selected by highest row variance。也就是说PCA分析的时候，是根据基因表达的counts值来的。如果给出了ntop，那么意思就是只选出表达量高的这几个基因去计算。没想通作者为什么设置这个，我觉得应该是先筛选出差异的基因，然后再设置这个数会比较好，这样就是看筛选出的基因是不是符合预期。反正感觉ntop目前来说用的不是很多。

returnData：返回PC1和PC2的dataframe

官方解释：should the function only return the data.frame of PC1 and PC2 with intgroup covariates for custom plotting (default is FALSE)。注意只返回PC1和PC2，其他的成分不返回，而且还返回分组情况和样本名。是这种格式：

              PC1         PC2 group condition  name
X11_T  23.7381223  -3.9537594    II        II X11_T
X77_T  -1.7273395  29.0222667    II        II X77_T
X14_T -14.2359870   1.8616294    II        II X14_T
X76_T  -0.2251326  27.9834964    II        II X76_T
X72_T  -9.9218391  19.7866404    II        II X72_T
X20_T  12.1552460 -19.1133494    II        II X20_T
X71_T -45.6232065  -1.7467169    II        II X71_T

这个参数的作用就是当你的PCA图需要加样本名的时候，也就是你希望在PCA图上知道哪个点是哪个样本，你就需要导出这个。
其实我的初衷也就是想看在PCA图上哪个点是哪个样本，因此我当然要设置returnData=T。

#构建dds
dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData=indata, colData = state, design= ~ condition )
#归一化，因为样本量超过了30，因此用vst
vsd <- vst(dds, blind = FALSE)
#返回样本名和分组
pcaData <- plotPCA(vsd, intgroup=c("condition"),returnData = T)
#这里按照condition排序了，原因见下。
pcaData <- pcaData[order(pcaData$condition,decreasing=F),]
#知道每一个组有多少样本
table(pcaData$condition)
# II III  IV 
# 20  11  10 
#根据上面的结果，设置每一个组的数量，方便加颜色；这一步是把每一个样本根据分组情况画出来，效果见图1
plot(pcaData[,1:2],pch = 19,col= c(rep("red",20),rep("green",11),rep("blue",10)),
     cex=1)
#加上样本名字，效果见图2
text(pcaData[,1],pcaData[,2],row.names(pcaData),cex=1, font = 1)
#加上图例，效果见图3
legend(-70,43,inset = .02,pt.cex= 1.5,title = "Grade",legend = c("II", "III","IV"), 
       col = c( "red","green","blue"),pch = 19, cex=0.75,bty="n")

图1 只画点
图2 加了样本名
图3 加上图例

下面说一下我画这个图的艰辛的过程。

首先，给PCA上每一个点加样本名这个过程其实是分步骤进行的。也就是我三个图的展示，即：画点、加样本名，加图例。分别用了plot(),text(),legend()，三个函数。

plot函数

plot函数是最基本的画图函数，感觉网上说的挺全的，这里引用https://blog.csdn.net/sl_world/article/details/80864674和https://blog.csdn.net/eric_e/article/details/83243999，自己也收藏一下。
本例中直接用的是PCA中的PC1和PC2，也就是pcaData[,1:2]。col颜色，是根据分组加的，我感觉是根据pcaData中的顺序，因为我之前试过：

plot(pcaData[,1:2],pch = 19,col= c("red","green","blue"),cex=1)

效果如图4

图4

在这图中，点的颜色完全是根据pcaData的顺序加的，如下

              PC1         PC2 group condition  name
X10_T  -4.9487193 -30.3912003   III       III X10_T
X11_T  23.7381223  -3.9537594    II        II X11_T
X12_T -56.8346035 -14.8049233   III       III X12_T
X77_T  -1.7273395  29.0222667    II        II X77_T
X14_T -14.2359870   1.8616294    II        II X14_T
X76_T  -0.2251326  27.9834964    II        II X76_T

可以对比pcaData和图4，完全就是红绿蓝，红绿蓝这种，而不是按照condition划分的。

所以在我的代码中，我先把pcaDatacondition排序了，然后根据table知道每一个组有几个，再设置颜色。

text函数

推荐参考http://www.mamicode.com/info-detail-1774107.html讲的还是很详细的，也给自己收藏一下。比较重要的参数是text(x,y,label)是最基本的，x,y分别是确定位置；label是文本的内容；另外还可以通过adj,pos对文字的位置进行调整。

legend函数

推荐参考https://www.jianshu.com/p/004f00142d00，其实一直很想把图例放在图的外面，现在还没有做成。

参考：https://www.jianshu.com/p/e03af1169e57
https://www.jianshu.com/p/53258de21108