三叶青多糖具有独特的药理活性,在临床应用中具有很大潜力。但由于多糖的结构复杂,导致其结构测定及合成具有一定的难度和特殊性。同时其在天然产物中含量较低而不易被分离,为多糖研究和临床应用带来了挑战。
一、多糖的分离
三叶青中多糖的提取方法主要有回流法、沸水法、稀酸法、超声法、稀碱法I和稀碱法Ⅱ。其中稀碱法I和稀碱法Ⅱ的多糖提取效率高于其他提取方法。而067稀碱法Ⅰ略高于稀碱法Ⅱ,通过条件优化,确定提取温度为70℃、提取时间为1.5h、液料比为35:1、提取次数为2次建立最佳的稀碱法I三叶青多糖提取条件。而在后续的多糖纯化条件优化实验中选定,静置时间为5h,7000min为最佳转速,5min为最佳离心时间建立三叶青多糖的纯化方法。由于碱性条件会破坏蛋白质与多糖的共价结合,释放更多的多糖类物质,因此多糖类物质的提取效率在碱性条件下与pH成正比。但在实际的提取分离中,考虑到其他成分的协同提取,在不适合采用稀碱法的情况下,回流法是比较理想的选择。另外俞盈等申请了三叶青藤多糖提取物及其制备方法和应用的发明专利,为三叶青多糖成分的生物活性研究提供了方法支撑。
二、多糖的测定
由于多糖的结果复杂,其多糖含量的测定存在一定难度,目前多采用葡萄糖+3,5-二硝基水杨酸液和水+3,5-二硝基水杨酸液作为测定基质溶液。在优化波长范围时发现在400~480mm以上两溶液的吸光值不稳定,而在580~600mm葡萄糖+3,5-二硝基水杨酸液的吸光值接近于0,因此将测定的波长范围拟定在480~570m。经过进一步的实验条件优化,确定水浴加热时间5min加热温度90℃、静置时间20min、3,5-二硝基水杨酸的用量7mL为三叶青多糖的最佳测定实验条件。
目前的三叶青化学成分测定主要依赖于传统的理化鉴定手段,主要依据一类指标成分的化学特征,如特定的显色反应,随着高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、高效毛细管电泳(HPCE)等色谱技术的发展和色谱-光谱联用鉴定技术的出现,可以精确反映中药材的化学组分,迅速地成为中药鉴定和质量控制与评价的有效手段。化学鉴定方法的另一大类是光谱分析技术,该技术以红外光谱、紫外光谱、ⅹ-衍射光谱、拉曼光谱、荧光光谱等技术为代表,在混合组分的特征分析上具有独特的优势。范世明等还提供了一种检测三叶青叶中多种化学成分的方法与流程,为三叶青叶的开发利用和质量评价提供了可靠的实验依据。
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