从新鲜样本到FFPE样本，空间转录组测序已经把可用有意义的临床样本最大程度地利用到疾病的研究中。然而，在实际的实验过程中，由于新鲜包埋样本或者FFPE样本一些本身问题和技术平台的限制，导致我们理想中的空间转录组测序并不是一帆风顺。
之前的Visium 新鲜样本实验需要对术后的样本进行及时冰冻包埋，且大小不能超过6.5*6.5mm 的芯片规格，对冰冻样本的RNA质检结果需要达到RIN值7以上。同时，该实验需要一次性同时做4个矩阵，即需满足4个样本切片，样本质检的透化预实验时间还需比较接近。
之前的Visium FFPE实验需要将石蜡样本进行切片，贴片到Visium芯片并经过质检及粘附性测试后，才能进行后续实验，对样本质量要求较高。在实验中经常会面临以下问题：
（1）无法转移已经贴片到普通玻片的稀有样品；
（2）无法只针对感兴趣的区域进行分析；
（3）6.5*6.5mm 的芯片规格无法一次性对大面积的组织进行分析；
（4）石蜡样本保存时间过长，质检不合格或切片过少，不满足粘附性测试；
（5）石蜡样本不允许带出医院等。
针对上述问题，10x Genomics推出了全新的Visium CytAssist空间转录组，能够直接将新鲜冰冻样本、FFPE组织切片上的转录组和蛋白质分析物从标准的组织学载玻片转移到Visium玻片上，无需进行多次切片贴片及粘附性测试实验，极大的简化了样本的处理。
CytAssist 实验流程
>>> Visium CytAssist可方便地转移FFPE样本中的转录组分析物
在Visium CytAssist流程中，切片、脱蜡以及染色和成像（H&E或IF）的步骤是在标准载玻片上进行的。在探针杂交后，将两张标准载玻片和一张含两个捕获区域的Visium玻片放入CytAssist仪器中，让标准载玻片上的组织切片与两个Visium捕获区域的顶部对齐，并通过 Visium CytAssist 仪器捕捉明场图像，确定感兴趣的病理区域；接着，运行Visium CytAssist 仪器将普通玻片组织切片上选定目标区域的探针原位转移到 Visium 捕获区，Visium 捕获区域通过带有不同位置标签的探针捕获转录组信息（探针释放和捕获），从而获取石蜡切片不同空间位置的转录表达水平。其余步骤（从探针延伸开始）按照Visium FFPE标准流程在仪器外进行。
常规 Visium vs CytAssist
>>> CytAssist优势
1、兼容样本类型更丰富
适用于新鲜样本、普通石蜡块组织、存档的玻片样本、已经通过H&E染色或者免疫荧光染色贴在普通玻片上的样本等。
2、简化样本处理
直接将转录组分析物从标准载玻片转移到Visium玻片的捕获区域。
3、样本质量要求降低
DV200 > 30% 即可进行后续实验。
4、高灵敏度
独特的RTL探针设计，每个基因设置1~3对捕获探针，高特异性、高灵敏地捕获所有基因。
5、芯片配置更灵活
兼具 6.5 mm*6.5 mm 和 11 mm*11mm 两种规格，较大组织也可一次性完成检测，适用于更多组织类型。
6、获得更多的空间见解
通过标准的组织学技术预先筛选组织切片，选择出最有生物学意义的切片
7、缩短实验周期
使用CytAssist专用玻片和试剂，每次运行可从最多两张FFPE组织切片中精确捕获分析物，而时间不到一小时。
8、多组学分析
提供商业化的35种蛋白组合试剂盒，可以对同一FFPE样本进行转录组和蛋白质的同时分析，对基因表达检测的同时检测几十种蛋白。
>>> 送样要求
10x Genomics官方推荐的品牌玻片有效区域示意图
>>> 数据表现
1、更高的测序深度
使用CytAssist的组织测序数据的利用率更高，获得更多的差异表达基因数量，从而获取更多有意义的信息。
（1）人类卵巢癌组织及人脑组织
Direct placement 和CytAssist-enabled处理的人组织的指标的比较
人类卵巢癌组织（A）与人脑组织（B）的差异基因分析
（2）小鼠脑组织及脾组织
Direct placement 和CytAssist-enabled处理的小鼠组织的指标的比较
小鼠大脑（A）与小鼠脾脏（B）的差异基因分析
2、更高的覆盖率（更多的转录组被探针集覆盖）和灵敏度
对于人类卵巢癌，CytAssist的数据显示了更高的敏感性和覆盖率，同时保持了可比性的整体空间组织。
两种方法：Direct placement (top) 和 CytAssist enabled (bottom)分析的人卵巢癌基因表达的对比
3、更明确的空间聚类结果
CytAssist处理的小鼠脾组织具有更明确的空间聚类，个体标记物分布更清晰。
>>> 发表文章
2022 年 10 月 6日，来自 10x Genomics 的科学家在 BioRxiv 上发表了“High resolution mapping of the breast cancer tumor microenvironment using integrated single cell, spatial and in situ analysis of FFPE tissue”论文。在文中10x Genomics的科学家展示了Xenium 原位技术的实际效果，通过Chromium Fixed RNA Profiling技术和CytAssist技术的联合，实现了FFPE样本单细胞水平下基因表达，空间信息及原位蛋白表达信息的高效检测效率。同时，通过CytAssist技术能够对同一张FFPE切片进行蛋白质和RNA的定量检测，从而实现基因表达和组织学图像的完美结合。
实验设计
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